Il metabolita è influenzato da fattori come l'ambiente genomico e le pratiche di gestione. Comprendere le interazioni tra questi fattori potrebbe consentire una previsione e una gestione più accurate della resa e della qualità di un prodotto. Incorporando una terza fase mobile, piuttosto che le due tradizionali, questa tecnica consente la separazione e il rilevamento di una gamma più ampia di metaboliti.
La metabolomica potrebbe essere applicata a qualsiasi area della biologia. In primo luogo, per ottenere una comprensione più profonda della biochimica di un organismo e aiutare a spiegare la loro risposta allo stress abiotico o biotico in relazione alla fisiologia. In secondo luogo, associare i biomarcatori alla perturbazione in esame.
Poiché l'alcol isopropile è un solvente viscoso, dovrebbe essere introdotto a bassa velocità di brillamento e un tempo di equilibrazione sufficiente utilizzato prima di aumentare la composizione al 98%Questi passaggi impediranno al sistema grafico cromatico di esercitare pressioni eccessivo, restituire un errore o potenzialmente danneggiare la colonna analitica. Per iniziare la preparazione dei grani, utilizzare un frullatore da laboratorio per macinare il grano. Eseguire il frullatore ad alta velocità per 20 secondi e quindi ripetere.
Rimuovere il barattolo del frullatore dalla base. Toccare il lato del barattolo del frullatore per portare qualsiasi grana macinata grossolanamente sulla superficie del campione. La grana macinata grossolanamente può essere scartata o immagazzinata.
Trasferire la grana finemente macinata dal frullatore a un tubo di micro centrifuga in plastica da due millilitri. Lo stesso giorno dell'estrazione, preparare il solvente da estrazione, come descritto nel manoscritto. Quindi, pesare 200 milligrammi di grano finemente macinato in un tubo di micro centrifuga da due millilitri.
Aggiungere 500 microlitri di solvente da estrazione al grano nel tubo. Inoltre, preparare un vuoto aggiungendo 500 microlitri di solvente da estrazione a un tubo vuoto. Utilizzando un omogeneizzatore, impostato a 6.500 giri/min, mescolare il solvente e il grano per 20 secondi.
Quindi, ripetere per altri 20 secondi. Quindi, centrifugare il tubo a quattro gradi Celsius e 16, 100 volte G, per cinque minuti. Trasferire il supernatante in un tubo di plastica da due millilitri e trattenere il pellet.
Ripetere due volte il processo di estrazione sul pellet. Unire i tre supernatanti, producendo un volume totale di estratto di circa 1,5 millilitri e mescolare con vortici. Per realizzare un campione in pool di tutti gli estratti di grano da utilizzare per il controllo qualità, trasferire 55 microlitri di ogni estratto di grano in un tubo e vortice a due millilitri.
Quindi, trasferire 50 aliquote microliter di questo campione in pool su flaconcini di vetro. Trasferire un'aliquota di 50 microliter di ogni estratto di campione di grano su flaconcini di vetro. Come descritto nel manoscritto scritto, preparare le soluzioni che saranno necessarie per la spettrometria di massa della cromatografia liquida.
Il giorno dell'analisi LCMS, preparare 100 millilitri di acetonitrile al 5%, contenenti 200 nanogrammi per millilitro leucina enkephalin. Aggiungere 950 microlitri di questa soluzione al flaconcino di vetro contenente l'aliquota di 50 microlitri dell'estratto di grano. Mescolare il contenuto nel flaconcino con il vortice.
In primo luogo, impostare un calibrare gli strumenti come descritto nel manoscritto e la guida per l'utente del produttore. Successivamente, eliminare e sciacquare il sistema di fluidici LC utilizzando solventi di grado LCMS, inclusi i solventi mobili di fase e lavaggio. Equilibrare il sistema LC utilizzando le condizioni di partenza del metodo LC, assicurando che la pressione della colonna si sia stabilizzata.
Impostare la tabella delle sequenze di strumenti. Iniettare il formato sodio all'inizio della sequenza del campione per controllare la calibrazione dello strumento. Analizzare prima i vuoti di solvente e preparativo, seguiti da campioni di controllo qualità raggruppati per il condizionamento dell'impianto e quindi dall'elenco dei campioni randomizzati.
Eseguire campioni di controllo qualità a intervalli regolari, come replica tecnica. Eseguire due campioni di controllo qualità alla fine della sequenza. Mentre la sequenza è in esecuzione, controllare la qualità dei dati, inclusa sia la precisione di massa standard interna che la riproducibilità del segnale.
Per controllare la riproducibilità del segnale, dovrebbe essere sufficiente l'ispezione visiva degli spettri sovrapposti. Nella soluzione utilizzata per preparare gli estratti di grano sono stati inclusi quattro standard interni. Durante l'LCMS, sono state osservate una buona precisione di massa e una singola riproducibilità degli standard interni sia per le modalità di ionizzazione positiva che per la modalità di ionizzazione negativa.
Sulla base dell'analisi degli spazi vuoti, 421 segnali in modalità negativa e 835 segnali in modalità positiva sono stati giudicati artefatti. Questi segnali erano presenti in spazi vuoti ad intensità pari o superiori al 5% della singola intensità media nei campioni di grano. Dopo la rimozione degli artefatti e l'ulteriore filtraggio dei dati, la modalità negativa ha restituito 483 funzionalità e la modalità positiva ha restituito 523 funzionalità.
Circa 250 caratteristiche erano biologicamente rilevanti e differivano significativamente per intensità tra le varietà di grano. Le misure di controllo qualità, come l'inclusione di spazi vuoti preparativi, standard interni e campioni raggruppati, sono importanti da ricordare in questo protocollo.
