È stata riportata una riprogrammazione diretta per generare melanociti. Tuttavia, vari fattori di trascrizione sono utilizzati in diversi studi. In questo protocollo, abbiamo convalidato e ridotto il numero del fattore di trascrizione ancora con una maggiore efficienza di riprogrammazione.
Abbiamo stabilito un sistema di riprogrammazione diretta per generare melanociti utilizzando solo tre fattori di trascrizione, Mitf, Sox10 e PAX3, e modificato il sistema di coltura per renderlo più stabile e robusto. Come rigenerare i melanociti funzionali è una domanda significativa che può aiutare ad affrontare le limitazioni della terapia per le malattie da depigmentazione come la vitiligine. La giusta riprogrammazione fornisce una prospettiva La nostra tecnica ha le caratteristiche di convenienza, forte operabilità e stabilità, che è più facile da promuovere e ripetere.
Per iniziare la produzione del lentivirus concentrato, piastrare 1,5 volte 10 alle 6 cellule HEK-293T in un piatto da 60 millimetri e coltivare le cellule con mezzo normale a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore di incubazione, quando le cellule HEK-293T hanno raggiunto l'80-90% di confluenza, sostituire il mezzo con 3,5 ml di DMEM, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% per due ore. Dopo aver rimosso le cellule dall'incubatore, sostituire il mezzo con DMEM contenente il 2% di FBS e aggiungere la miscela complessa di trasfezione appena preparata alle cellule in modo a goccia.
Mescolare delicatamente la miscela liquida. Al termine di otto ore, cambiare il mezzo cellulare con 3,5 ml di mezzo normale. Raccogliere il surnatante del virus a 24 e 48 ore.
Quindi, mescolare i supernatanti virali raccolti in due diversi punti temporali e centrifugare la miscela a 200 xg per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi passare il surnatante raccolto attraverso filtri da 0,45 micron per raccogliere il filtrato in un tubo conico sterile da 50 ml. Concentrare il surnatante virale filtrato mediante centrifugazione a 6.000 xg a quattro gradi Celsius durante la notte.
Una volta fatto, assicurarsi che il pellet di virus sia visibile nella parte inferiore del tubo conico. Versare lentamente il surnatante. Per sciogliere il pellet di virus nel mezzo normale con uno per 100 ° * volume del surnatante del virus.
Utilizzare una micropipetta P1000 per pipettare su e giù delicatamente fino a ottenere una miscela di virus concentrata omogenea 100x. Dividere il virus concentrato nei tubi microcentrifuga per immagazzinare a 80 gradi Celsius. Piastra 1 volte 10 alla 5a cella HEK-293T in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
Coltiva queste cellule con il mezzo normale a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore, aggiungere da 0,1 a 0,2 microlitri del virus concentrato fluorescente 100x a ciascun pozzetto. Seguito dall'aggiunta di quattro nanogrammi per microlitri del reagente di trasfezione polimerica cationica a ciascun pozzo.
Circa otto-dodici ore dopo l'infezione con il virus, sostituire il mezzo con il mezzo normale. A quarantotto ore dopo l'infezione, lavare il piatto con 1 ml di PBS sterile per rimuovere le cellule morte. Quindi tripsinizzare le cellule utilizzando 250 microlitri di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% per pozzetto di una piastra a sei pozzetti a temperatura ambiente.
Centrifugare la piastra a 200 xg per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante, sospendere nuovamente il pellet cellulare in un mL di PBS e aggiungere la sospensione cellulare a un tubo a fondo tondo di polistirene da cinque ml. Quindi posizionare il tubo nel citometro a flusso per analizzare il campione.
Per la riprogrammazione diretta dei fibroblasti, rivestire un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti con 1 mL di soluzione di gelatina allo 0,1% a temperatura ambiente. Dopo 15-30 minuti, quando il pozzetto è completamente coperto con la gelatina, aspirare la soluzione di gelatina allo 0,1%. Successivamente, placcare 5 volte 10 al 4 ° fibroblasti embrionali di topo, o MEF, in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti rivestita con gelatina allo 0,1% e coltivare le cellule durante la notte con il mezzo normale a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica.
Dopo 24 ore, quando i MEF hanno raggiunto il 40-50% di confluenza, sostituire il mezzo con il mezzo normale. Quindi, sciogliere il virus congelato e concentrato sul ghiaccio. Calcola il volume del virus da aggiungere usando l'equazione e quindi aggiungi il virus concentrato per i sei fattori di trascrizione a ciascun pozzo, in base al volume calcolato.
Aggiungere quattro microgrammi per mL dell'agente di trasfezione polimerica cationica al pozzo. Consideralo come il giorno zero dell'infezione da lentivirus. Il primo giorno, dopo 8-12 ore di infezione, sostituire il mezzo contenente il virus con il mezzo normale fresco, aggiungendo 0,5 microgrammi per mL di puromicina per lo screening di linee cellulari infette stabili.
Il secondo giorno, 48 ore dopo l'infezione, sostituire gradualmente il mezzo surnatante con il mezzo di riprogrammazione. Modificare un quarto del volume medio totale prima di aggiungere tre micromolari CHIR99021. Dal terzo al settimo giorno, a seconda delle condizioni delle cellule, cambiare il mezzo sostituendolo gradualmente con una percentuale maggiore di mezzo di riprogrammazione per passare al mezzo di riprogrammazione completo entro cinque giorni.
Successivamente, staccare le cellule con 500 microlitri dell'enzima digestivo 0,05% tripsina-EDTA per tre minuti a temperatura ambiente. Quando circa il sessanta percento delle cellule ha galleggiato, interrompere la digestione aggiungendo il mezzo normale, due volte il volume dell'enzima digestivo. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico sterile da 15 ml per centrifugare a 200 xg per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante prima di sospendere nuovamente il pellet cellulare con il mezzo di riprogrammazione. Al termine, placcare le cellule ri-sospese in un piatto sterile di 60 millimetri. Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica umidificato al 5%.
Dopo quarantotto ore di infezione da lentivirus nelle cellule HEK-293T, il successo della produzione concentrata di lentivirus è stato valutato osservando l'intensità di fluorescenza della GFP o mediante citometria a flusso. Il titolo del virus concentrato è risultato essere alto a 10 a 8th TU / mL. Durante la riprogrammazione diretta dei fibroblasti, la morfologia cellulare è cambiata gradualmente in sinapsi cellulari allungate e nuclei cellulari allargati.
Tuttavia, le cellule sono progressivamente invecchiate dopo il ventesimo giorno. La rimozione dei fattori di trascrizione, Mitf, Pax3 o Sox10, ha portato al silenziamento dell'espressione dei geni melanocitici, Tyr, Tyrp1 e Mlana, indicando il maggiore impatto sulla conversione dei fibroblasti in melanociti. Quindi, l'espressione di geni melanocitici indotta dalla programmazione diretta con tre fattori di trascrizione era più alta rispetto a sei fattori di trascrizione.
Per identificare i melanociti indotti da MEF, o iMels, l'espressione di marcatori melanocitici, TYRP1 e DCT è stata rilevata utilizzando la colorazione immunofluorescente. Inoltre, i metodi di colorazione specifici della melanina come la colorazione DOPA e Masson-Fontana hanno mostrato risultati positivi. Le celle 293T devono essere distribuite uniformemente.
Inoltre, l'aggiunta di miscela di trasfezione alle cellule deve essere eseguita delicatamente per evitare che le cellule galleggino. Il protocollo è stabile e pratico e può essere utilizzato per riprogrammare altri tipi di cellule. Si aspetta di fornire un riferimento e una strategia per la riprogrammazione diretta in vivo nella rigenerazione dei melanociti nella medicina futura.
