Questo è il metodo più robusto e sensibile per valutare la sensibilità olfattiva nei pesci marini in quanto registra un segnale puramente sensoriale prima di qualsiasi lavorazione da parte del SNC. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua sensibilità e che può essere facilmente trasferita a una specie diversa da un ambiente diverso indipendente dalla salinità esterna. Per preparare l'acqua di controllo, raccogliere un litro di acqua di mare filtrata a carbone e utilizzare una sonda di pH per controllare il pH.
Il pH dovrebbe essere intorno alle 8.2. In caso di no, far bollire l'acqua di mare con aria atmosferica fino a raggiungere un pH di 8,2. Successivamente, utilizzare un titratore di alcalinità per misurare l'alcalinità dell'acqua, quindi misurare la temperatura e la salinità dell'acqua.
Per preparare acqua ad alta anidride carbonica, filtrare un litro di acqua di mare attraverso filtri a carbone inattivati dal particolato prima di gorgogliare con anidride carbonica fino a raggiungere il pH desiderato. Utilizzare una sonda di pH per controllare il pH, che dovrebbe essere di circa 7,7, quindi utilizzare un titratore di alcalinità per misurare l'alcalinità dell'acqua e misurare la temperatura e la salinità dell'acqua. Per determinare la pressione dell'anidride carbonica sia nell'acqua di controllo che in acqua ad alta anidride carbonica, aprire un programma software progettato per calcolare i parametri di anidride carbonica nell'acqua e aggiungere la salinità dell'acqua, la temperatura, la pressione, l'alcalinità totale e i valori di pH nella finestra di ingresso.
Quindi selezionare le costanti, le scale e le unità e fare clic sul processo per determinare la pressione dell'anidride carbonica. Dopo aver confermato un adeguato livello di sedazione per mancanza di risposta al pizzico di coda, posizionare il pesce anestetizzato su un supporto del cuscino personalizzato per il modello e posizionare un tubo di silicio di dimensioni appropriate nella bocca del pesce. Il tubo è collegato a una pompa sommergibile e un serbatoio di anestetico contenente acqua di mare e acqua aerata viene pompato sulle branchie in una velocità di circa 100 millilitri al minuto per chilogrammo.
Quindi, inserire un perno di messa a terra nel muscolo del fianco e collegare il perno allo stadio di testa dell'amplificatore. Coprire il pesce con un panno umido con solo la testa esposta e posizionare il tubo con il sistema di erogazione dello stimolo all'interno della narice. Per esporre i nervi olfattivi, utilizzare un trapano e un microscopio sezionante per rimuovere la pelle e l'osso del cranio tra gli occhi.
Quando si utilizza un'orata, utilizzare una sega circolare per rimuovere la parte del cranio immediatamente sopra gli occhi solo posteriore agli occhi e utilizzare il trapano per rimuovere l'osso tra gli occhi. Una volta che l'osso è stato eliminato, utilizzare le forcelle fini per rimuovere il grasso e il tessuto connettivo sovrascrivono i nervi olfattivi senza danneggiare i nervi o i vasi. Pulire gli elettrodi prima dell'uso collegandoli al polo negativo di una sorgente CC a tre volt e posizionando la punta in salina fisiologica per 20-30 secondi.
Un flusso costante di piccole bolle dovrebbe essere visto proveniente dalla punta. Collegare gli elettrodi di tungsteno rivestiti di parilene allo stadio di testa di un preamplificatore CA a corrente alternata. Una volta esposti i nervi olfattivi, utilizzare micro manipolatori per inserire gli elettrodi nel nervo olfattivo appropriato in una posizione che dia la massima risposta allo standard e una risposta minima al vuoto.
A condizione che la dissezione sia andata liscio, il passaggio critico è portare gli elettrodi nella posizione corretta. Questo può richiedere tempo e comporta un certo grado di tentativi ed errori. Per ottenere letture elettrofisiotiche, utilizzare una valvola a tre vie azionata da solenoide per impostare un sistema di erogazione dello stimolo per consentire il rapido passaggio dall'acqua di fondo pulita allo stimolo contenente acqua e collegare l'uscita comune al tubo che trasporta acqua alla rosetta olfattiva.
Posizionare una linea in acqua di mare di sfondo e l'altra nella soluzione di prova. Collegare il driver della valvola al grilletto di un convertitore digitale analogico e configurare il software per avviare la registrazione all'evento trigger e continuare per un periodo predeterminato. Per verificare la stabilità della preparazione, registrare e misurare ripetutamente l'ampiezza della risposta integrata con lo standard che consente di trascorrere un minuto tra stimoli successivi.
Successivamente, registrare le risposte nervose olfattive agli amminoacidi nel controllo dell'acqua di mare e lasciare passare un minuto tra gli stimoli successivi, quindi registrare la risposta a uno per 10 alla terza serina molare negativa in una soluzione vuota di acqua di controllo. Quindi registrare le risposte nervose olfattive agli amminoacidi in acqua di mare ad alta anidride carbonica. La risposta a una soluzione vuota di acqua ad alta anidride carbonica e la risposta a una per 10 alla terza serina molare negativa in una soluzione vuota di acqua di controllo.
Qui vengono mostrate risposte tipiche agli stimoli di controllo positivi e negativi registrati dal nervo olfattivo di un'orata. Entro circa un secondo dall'applicazione dello stimolo, un rapido aumento dell'attività può essere osservato seguito da un periodo di accomodamento mentre lo stimolo è ancora presente e un ritorno all'attività di base una volta terminato lo stimolo. Al contrario, uno stimolo vuoto evoca poca o nessuna risposta.
In questa tipica curva di risposta alla concentrazione, si può osservare che l'aumento delle concentrazioni di un odorante può evocare aumenti sempre maggiori dell'attività e quindi ampiezza delle risposte integrate. La tracciatura dei dati normalizzati e la corrispondente regressione lineare consentono di stimare la soglia di rivelazione per le risposte di concentrazione di ciascun animale o di un gruppo di animali. Le curve di risposta alla concentrazione sigmoidale possono essere tracciate semi-logaritmicamente, consentendo il calcolo della concentrazione di odori che evoca al 50% di risposta massima.
È importante mantenere il pesce il più sano possibile. Ad esempio, assicurarsi che le branchie siano adeguatamente irrigate e che l'epitelio olfattivo sia mantenuto bagnato durante la registrazione. Uno dei nostri obiettivi è rintracciare i percorsi neurali nel cervello dove vengono trasmesse le informazioni sensoriali.
