Este é o método mais robusto e sensível para avaliar a sensibilidade olfativa em peixes marinhos, pois registra um sinal puramente sensorial antes de qualquer processamento pelo SNC. As principais vantagens dessa técnica são sua sensibilidade e que ela pode ser facilmente transferida para uma espécie diferente de um ambiente diferente independente da salinidade externa. Para preparar a água de controle, colete um litro de água do mar filtrada por carvão e use uma sonda de pH para verificar o pH.
O pH deve ficar em torno de 8,2. Se não for, borbulhe a água do mar com ar atmosférico até que um pH de 8,2 seja atingido. Em seguida, use um titrator alcalinidade para medir a alcalinidade da água, em seguida, medir a temperatura da água e a salinidade.
Para preparar água com dióxido de carbono elevado, filtrar um litro de água do mar através de filtros de carvão inativados de partículas antes de borbulhar com dióxido de carbono até que o pH desejado seja atingido. Use uma sonda de pH para verificar o pH, que deve ser em torno de 7,7, em seguida, use um titrator alcalinidade para medir a alcalinidade da água e medir a temperatura da água e a salinidade. Para determinar a pressão de dióxido de carbono tanto no controle quanto na água de dióxido de carbono elevado, abra um programa de software projetado para calcular parâmetros de dióxido de carbono na água e adicione a salinidade da água, temperatura, pressão, alcalinidade total e valores de pH na janela de entrada.
Em seguida, selecione as constantes, escalas e unidades e clique no processo para determinar a pressão do dióxido de carbono. Depois de confirmar um nível apropriado de sedação por falta de resposta ao pinça da cauda, coloque o peixe anestesiado em um suporte de almofada personalizado para o modelo e coloque um tubo de silício de tamanho apropriado na boca do peixe. O tubo é conectado a uma bomba submersível e a um reservatório de anestésico contendo água do mar arejada e a água é bombeada sobre as brânquias em uma taxa de aproximadamente 100 mililitros por minuto por quilograma.
Em seguida, insira um pino de terra no músculo flanco e conecte o pino ao estágio da cabeça do amplificador. Cubra o peixe com pano úmido com apenas a cabeça exposta e posicione o tubo com o sistema de entrega de estímulos dentro da narina. Para expor os nervos olfativos, use uma broca e um microscópio dissecando para remover a pele e o osso do crânio entre os olhos.
Ao usar uma espuma do mar, use uma serra circular para remover a parte do crânio imediatamente acima dos olhos para apenas posterior aos olhos e use a broca para remover o osso entre os olhos. Uma vez que o osso suficiente tenha sido limpo, use fórceps finos para remover a gordura e o tecido conjuntivo sobreposto aos nervos olfativos sem danificar os nervos ou vasos. Limpe os eletrodos antes de serem usados conectando-os ao polo negativo de uma fonte DC de três volts e colocando a ponta em soro fisiológico por 20 a 30 segundos.
Um fluxo constante de pequenas bolhas deve ser visto vindo da ponta. Conecte eletrodos de tungstênio revestidos com parileno ao estágio principal de um preamplificador AC de corrente alternada. Uma vez expostos os nervos olfativos, use micro-manipuladores para inserir os eletrodos no nervo olfativo apropriado em uma posição que dê uma resposta máxima ao padrão e uma resposta mínima ao espaço em branco.
Desde que a dissecção tenha corrido bem, o passo crítico é colocar os eletrodos na posição correta. Isso pode levar tempo e envolve um certo grau de tentativa e erro. Para obter leituras eletrofisiológicas, use uma válvula de três vias operada por solenoide para configurar um sistema de entrega de estímulos para permitir a rápida mudança da água de fundo limpa para estímulos que contenham água e conecte a saída comum ao tubo que transporta água à roseta olfativa.
Coloque uma linha na água do mar de fundo e a outra na solução de teste. Conecte o driver da válvula ao gatilho de um conversor digital analógico e configure o software para iniciar a gravação no evento do gatilho e continuar por um período predeterminado. Para verificar a estabilidade da preparação, registe e meça repetidamente a amplitude da resposta integrada com o padrão permitindo que um minuto passe entre estímulos sucessivos.
Em seguida, regisine as respostas nervosas olfativas aos aminoácidos no controle da água do mar, e permita que um minuto decorra entre estímulos sucessivos, em seguida, regisine a resposta a uma vez 10 para o terceiro molar negativo serino em uma solução em branco de água de controle. Em seguida, registos as respostas nervosas olfativas aos aminoácidos em alta água do mar de dióxido de carbono. A resposta a uma solução em branco de água com dióxido de carbono elevado e a resposta a uma vezes 10 ao terceiro molar negativo serino em uma solução em branco de água de controle.
Aqui, são mostradas respostas típicas a estímulos de controle positivos e negativos registrados a partir do nervo olfativo de uma bream marinha. Dentro de cerca de um segundo da aplicação de estímulo, um rápido aumento da atividade pode ser observado seguido por um período de acomodação enquanto o estímulo ainda está presente e um retorno à atividade de base uma vez que o estímulo tenha terminado. Em contraste, um estímulo em branco evoca pouca ou nenhuma resposta.
Nesta típica curva de resposta à concentração, observa-se que o aumento das concentrações de um odorno pode evocar aumentos cada vez maiores na atividade e, portanto, amplitude das respostas integradas. A plotagem dos dados normalizados e a regressão linear correspondente permitem a estimativa do limiar de detecção para as respostas de concentração de cada animal ou de um grupo de animais. As curvas de resposta à concentração sigmoidal podem ser plotadas semi-logaritmicamente, permitindo o cálculo da concentração odonte que evoca a 50% de resposta máxima.
É importante manter o peixe o mais saudável possível. Por exemplo, certifique-se de que as brânquias são adequadamente irrigadas e que o epitélio olfativo é mantido molhado durante a gravação. Um dos nossos objetivos é traçar as vias neurais no cérebro até onde a informação sensorial é retransmitida.
