I dati rappresentativi sono stati finanziati attraverso il National Cancer Institute (K22CA218549 a S.T.S). Oltre alla loro assistenza nello sviluppo del metodo di analisi completo qui riportato, ringraziamo l'Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Direttore - Krista La Perle, DVM, PhD) per i servizi di istologia e immunoistochimica e il Pathology Imaging Core per lo sviluppo e l'analisi degli algoritmi.

L'uso degli animali ha seguito i regolamenti dell'Università Laboratory Animal Resources (ULAR) nell'ambito del protocollo approvato dall'OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).
1. Iniezione della vena della coda delle cellule del cancro al seno
<ol><li>Preparazione di cellule e siringhe per iniezione<ol>
<li>Placcare un numero appropriato di cellule in base al numero di topi e alla concentrazione cellulare da utilizzare. NOTA: Il numero di cellule iniettate e il tempo per lo sviluppo delle metastasi dipenderanno dalla linea cellulare utilizzata e dovranno essere ottimizzati. In questa dimostrazione, 1 x 106 cellule MDA-MB-231 vengono iniettate per via endovenosa in topi NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) e le lesioni polmonari macroscopiche vengono osservate entro e non oltre 24 giorni dopo l'iniezione. Per la linea cellulare del tumore mammario murino MVT117, 3 x 106 cellule vengono iniettate in topi FVB/N immunocompatibili con numerose metastasi polmonari osservate da 14 giorni22,23.</li>
		<li>Aspirare i mezzi e le piastre delle celle di risciacquo con 1x PBS. Tripsinizzare le cellule in volume minimo, aggiungere il volume appropriato di media e contare le cellule utilizzando un ematocitometro o un altro metodo preferito. Il blu di tripano (0,4%) o altri coloranti a cellule vive / morte possono essere utilizzati per determinare la conta cellulare vitale.</li>
		<li>Celle a pellet ruotando a 180 x g per 5 min.</li>
		<li>Sospendere il numero appropriato di cellule in PBS sterile 1x in modo tale che venga iniettato un volume di 100 μL per topo. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio per mantenere la vitalità.</li>
		<li>Prima dell'iniezione, risospendare accuratamente le cellule con una pipetta da 200 μL o 1 mL per evitare l'aggregazione. Aspirare 100 μL in una siringa da insulina da 28 G (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Eliminare eventuali bolle d'aria mantenendo la siringa verticale, picchiettando la siringa e regolando lentamente lo stantuffo. L'iniezione di bolle d'aria nella vena è probabile che causi un'embolia aria / gas che può essere fatale.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniezione laterale della vena della coda NOTA: Per i test sperimentali di metastasi del cancro al seno, le iniezioni vengono eseguite su topi femmina di > 6 settimane.<ol>
<li>Maneggiare il mouse per la coda e far scivolare l'animale in un tubo/dispositivo di ritenuta a fessura di dimensioni appropriate (vedere la tabella dei materiali per il dispositivo di ritenuta utilizzato).</li>
		<li>Inserire la parte della spina del dispositivo di ritenuta e posizionare il mouse su un lato in modo tale che la sua vena laterale della coda sia facile da visualizzare. Il topo ha un'arteria ventrale in linea con i genitali, una vena dorsale e due vene caudali laterali.</li>
		<li>Pulire la superficie della coda del mouse con una salvietta asettica. Afferrare la coda tra indice e pollice con la mano non dominante e applicare una leggera tensione.</li>
		<li>A partire dalla porzione distale della coda, inserire l'ago parallelo alla vena con la fine smussata.</li>
		<li>Se consentito, ricapitolare attentamente l'ago e piegarlo con un angolo di 20-30 °. Un dispositivo di avvicinamento con una sola mano o un dispositivo di ricapitolazione dell'ago è altamente raccomandato. NOTA: Non è necessario aspirare in quanto ciò potrebbe causare il collasso della vena. Tuttavia, un piccolo lampo di sangue può essere visto quando viene posizionato per la prima volta. L'ago avanzerà dolcemente nella vena con un posizionamento corretto.</li>
		<li>Erogare lentamente il volume completo nella vena. Non ci dovrebbe essere resistenza quando lo stantuffo viene spinto.</li>
		<li>Se si avverte resistenza, rimuovere prontamente l'ago della siringa. Se necessario, reinserire l'ago (idealmente non più di 3 tentativi) spostandosi verso l'estremità prossimale della coda o la vena laterale opposta.</li>
		<li>Un piccolo volume di sangue sarà probabilmente spostato dopo l'iniezione. Applicare una leggera pressione con una garza sterile e pulire con una salvietta asettica.</li>
		<li>Smaltire tempestivamente la siringa in un apposito contenitore per taglienti.</li>
		<li>Riportare il mouse in una gabbia pulita e ventilata e monitorare i segni di pericolo.</li>
		<li>Monitorare i topi 2-3x / settimana per segni di formazione di metastasi (respirazione affannosa, postura curva, perdita di peso) e disagio generale. Il tempo di sviluppo delle metastasi dipenderà dalla linea cellulare e dal ceppo di topo.</li>
		<li>Se si utilizza un dispositivo di imaging animale vivo in vivo, i topi immagine immediatamente dopo l'iniezione della vena della coda per confermare il successo dell'iniezione di cellule e ottenere dati "zero" a tempo (dettagli specifici sull'imaging a bioluminescenza in vivo non sono inclusi nel presente documento, ma sono descritti da Yang et al.24).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fissazione del tessuto polmonare e analisi del carico tumorale polmonare metastatico
<ol><li>Gonfiaggio del tessuto polmonare per mantenere il formato strutturale dei polmoni per l'istopatologia<ol>
<li>Dopo aver seguito le procedure di eutanasia approvate (ad es. anidride carbonica al 30 - 70% di spostamento del volume della camera / min), fissare la carcassa del topo a una scheda di dissezione con perni. Spruzzare o applicare il 70% di etanolo per tenere la pelliccia del topo fuori mano durante la dissezione. NOTA: L'asfissia da anidride carbonica può causare emorragia polmonare come lesione di fondo prevista, specialmente a portate più lente.</li>
		<li>Aprire il torace con un'incisione della linea mediana, estendere l'incisione cranicamente / caudale attraverso il peritoneo e tagliare via il diaframma afferrando il processo xifoide.</li>
		<li>Usando un set separato di forbici per non opacizzare le lame, tagliare le costole lungo ciascun lato dello sterno e rimuovere con cura la gabbia toracica lasciando spazio ai polmoni per espandersi.</li>
		<li>Isolare la trachea rimuovendo le ghiandole salivari sottomandibolari e la muscolatura infraioide. Posizionare i perni su entrambi i lati della trachea può impedire movimenti indesiderati durante l'inserimento dell'ago.</li>
		<li>Riempire una siringa da 26 G con 2-3 mL di formalina tamponata neutra al 10% e inserirla nella trachea.</li>
		<li>Iniettare lentamente formalina e guardare per i polmoni di espandersi (di solito richiede ~ 1,5 ml di formalina).</li>
		<li>Una volta che la formalina inizia a fuoriuscire dai polmoni (evitare l'inflazione eccessiva), pizzicare la trachea con un paio di pinze, rimuovere l'ago della siringa e staccare l'intero apparato respiratorio. Posizionare polmoni, cuore, ecc. direttamente nella formalina poiché è possibile eseguire ulteriori rifilature del tessuto dopo la fissazione.</li>
		<li>Completa la lavorazione, l'incorporamento, il sezionamento del tessuto e la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E) utilizzando metodi standard.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi del carico tumorale polmonare metastatico<ol>
<li>Scansione di sezioni polmonari colorate di H&E su uno scanner a vetrini ad alta risoluzione con ingrandimento 40x (Figura 3).</li>
		<li>Importare immagini in un software di analisi delle immagini (ad esempio, Visiopharm Image Analysis) per la quantificazione delle metastasi polmonari. NOTA: si consiglia ai nuovi utenti di ottenere una formazione in loco o online per utilizzare il software di analisi delle immagini. Numerosi webinar sono disponibili anche attraverso la pagina web commerciale.</li>
		<li>Selezionare l'app Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis dalla libreria di app del software. NOTA: lo scopo di questa app è quello di etichettare e quantificare le metastasi polmonari sui vetrini colorati di H & E. Come parte dell'app 10118 H&E Lung Metastasis, la prima fase di elaborazione delle immagini segmenta il tessuto polmonare con l'app Tissue Detection. La seconda fase di elaborazione delle immagini utilizza l'app Metastasis Detect che identifica le metastasi all'interno del tessuto polmonare. Le metastasi sono identificate attraverso la forma insieme a regioni che sono troppo deformate, troppo rosse o troppo sparse per essere identificate come metastasi.</li>
		<li>Regola i parametri che definiscono la forma e la scarsità per adattarli al meglio alle immagini rappresentative. Le aree segmentate delle metastasi tumorali e del tessuto polmonare normale possono essere visualizzate utilizzando etichette di colore diverse per ogni tipo di tessuto. NOTA: nel caso in cui l'app non sia in grado di separare con precisione le metastasi dal tessuto polmonare normale, potrebbe essere necessario scrivere un'app personalizzata che utilizza il programma Visiopharm Decision Forest come è stato fatto per gli esperimenti (vedere figura 2 e figura 3). Di seguito sono riportati i dettagli per la scrittura di un algoritmo personalizzato. In caso contrario, procedere al passaggio 2.2.9.</li>
		<li>Apri il programma Decision Forest, che funziona addestrando più classi [ad esempio, tessuto polmonare (non neoplastico), metastasi, globuli rossi, epitelio e / o spazio bianco] su un'immagine desiderata. Nella Figura 2, le metastasi tumorali sono blu, il tessuto normale è verde e l'epitelio bronchiolare è giallo. Inoltre, i globuli rossi sono in rosso e gli spazi d'aria in rosa.</li>
		<li>Segui la serie di domande sì o no richieste per addestrare in modo appropriato ogni classe per un'immagine. L'accuratezza dell'algoritmo determinerà il numero di domande sì/no. Per l'analisi, l'algoritmo/app personalizzato è stato scritto con una precisione impostata su 50 (intervallo 0-100).</li>
		<li>Regola le funzionalità per ogni classe applicando filtri per affinare, sfocare, ordinare per forma, ecc. per migliorare l'accuratezza dell'algoritmo/app. Visiopharm visualizza ogni classe attraverso una o più lenti note come funzionalità. Le funzionalità modificano il modo in cui la classe vede l'immagine per far risaltare determinati colori o intensità. NOTA: per l'algoritmo personalizzato, le metastasi di 8500 μm2 e superiori sono etichettate e misurate come metastasi. Ciò tiene conto della varianza delle dimensioni e delle metastasi troppo piccole per essere rilevate. Piccole aree deformate e piccole aree metastatiche inferiori a 8500 μm2 sono state incluse nella normale quantificazione tissutale.</li>
		<li>Salva le impostazioni modificate dall'app o dall'algoritmo personalizzato e quindi applica l'algoritmo / app a un intero set o serie di tessuti colorati H & E.</li>
		<li>Infine, esportare tutte le variabili di output, incluse quelle elencate nella Tabella 1. L'area in micron al quadrato (μm2) può essere quantificata per ciascun tipo di tessuto e le percentuali sono derivate dall'area totale del tessuto netto del campione (cioè tessuto totale meno spazio aereo).</li>
		<li>Quando si crea un algoritmo personalizzato, rivedere i markup dei tessuti in consultazione con un patologo veterinario certificato dall'American College of Veterinary Pathologists per garantire misurazioni accurate e distinguere tra i tipi di tessuto.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+metastasis.">Targeting metastasis.</a> Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).</li><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).</li><li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perspective+on+cancer+cell+metastasis.">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).</li><li>Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+discovery+and+development+of+therapies+for+metastatic+breast+cancer.">Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).</li><li>Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+metastasis:+progress+and+prospects.">Mouse models of metastasis: progress and prospects.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).</li><li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis.">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).</li><li>Schoenenberger, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+c-myc+gene+expression+in+mammary+glands+of+transgenic+mice+induces+mammary+tumours+with+constitutive+milk+protein+gene+transcription.">Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription.</a> EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).</li><li>Nusse, R., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+tumors+induced+by+the+mouse+mammary+tumor+virus+contain+a+provirus+integrated+in+the+same+region+of+the+host+genome.">Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome.</a> Cell. 31 (1), 99-109 (1982).</li><li>Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+induction+of+mammary+adenocarcinoma+in+transgenic+mice+bearing+the+activated+c-neu+oncogene.">Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene.</a> Cell. 54 (1), 105-115 (1988).</li><li>Lin, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+to+malignancy+in+the+polyoma+middle+T+oncoprotein+mouse+breast+cancer+model+provides+a+reliable+model+for+human+diseases.">Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases.</a> American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).</li><li>Green, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C3(1)/SV40+T-antigen+transgenic+mouse+model+of+mammary+cancer:+ductal+epithelial+cell+targeting+with+multistage+progression+to+carcinoma.">The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma.</a> Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).</li><li>Iorns, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mouse+model+for+the+study+of+human+breast+cancer+metastasis.">A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis.</a> PloS One. 7 (10), 47995 (2012).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+Number+of+Women+Living+with+Metastatic+Breast+Cancer+in+the+United+States.">Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+and+survival+outcomes+in+patients+with+breast+cancer+and+lung+metastasis:+a+population-based+study.">Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study.</a> Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).</li><li>Smid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+breast+cancer+show+preferential+site+of+relapse.">Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse.</a> Cancer Research. 68 (9), 3108-3114 (2008).</li><li>Kennecke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+behavior+of+breast+cancer+subtypes.">Metastatic behavior of breast cancer subtypes.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).</li><li>Soni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+subtypes+predispose+the+site+of+distant+metastases.">Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases.</a> American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).</li><li>Leone, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+impact+of+metastatic+pattern+in+stage+IV+breast+cancer+at+initial+diagnosis.">Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).</li><li>Pei, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant-cell+culture+of+primary+mammary+tumors+from+MMTV-c-Myc+transgenic+mice.">Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).</li><li>Mathsyaraja, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF1-ETS2-induced+microRNA+in+myeloid+cells+promote+metastatic+tumor+growth.">CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth.</a> Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li><li>La Perle, K. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Pathologists:+Ultimate+Control+Freaks+Seeking+Validation.">Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation.</a> Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).</li><li>Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+of+metastasis:+mechanistic+insights+and+therapeutic+opportunities.">Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (10), (2018).</li><li>Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+immune+system+in+cancer:+from+tumor+initiation+to+metastatic+progression.">Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression.</a> Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).</li><li>Borowsky, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syngeneic+mouse+mammary+carcinoma+cell+lines:+two+closely+related+cell+lines+with+divergent+metastatic+behavior.">Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompetent+mouse+allograft+models+for+development+of+therapies+to+target+breast+cancer+metastasis.">Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis.</a> Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).</li><li>Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+assessment+of+tail-vein+injection+in+mice+using+a+modified+anaesthesia+induction+chamber+versus+a+common+restrainer+without+anaesthesia.">Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia.</a> Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).</li><li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model.">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).</li><li>Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+tumor+cell+dissemination+patterns+in+preclinical+models+of+cancer+metastasis+using+flow+cytometry+and+laser+scanning+cytometry.">Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).</li><li>Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer.">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Wright, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+breast+cancer+bone+metastasis.">Murine models of breast cancer bone metastasis.</a> BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+orthotopic+mouse+models+of+patient-derived+breast+cancer+brain+metastases+by+a+modified+intracarotid+injection+method.">Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method.</a> Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).</li><li>Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+for+treating+brain+metastases+from+breast+cancer.">Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer.</a> Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Stereology+Applications+for+the+Pathologist.">Practical Stereology Applications for the Pathologist.</a> Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).</li><li>Aeffner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Microscopy,+Image+Analysis,+and+Virtual+Slide+Repository.">Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Mentre i ricercatori continuano a utilizzare l'iniezione endovenosa di cellule tumorali come modello sperimentale per le metastasi, mancano pratiche standard per analizzare il carico tumorale metastatico risultante. In alcuni casi, differenze significative nel carico tumorale metastatico in caso di manipolazione di particolari linee cellulari e/o uso di composti chimici possono essere osservate macroscopicamente. Tuttavia, in altri casi, sottili differenze nella semina e nella crescita metastatica possono essere trascura...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.

Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Nonostante sia un processo altamente complesso e inefficiente1, le metastasi contribuiscono in modo significativo alla morbilità e alla mortalità dei pazienti oncologici2. In effetti, la maggior parte dei decessi correlati al cancro sono attribuiti alla diffusione metastatica della malattia3,4. Affinché le cellule tumorali possano metastatizzare con successo, devono staccarsi dal sito primario, invadere attraverso lo stroma adiacente, intravasare la circolazione sanguigna o linfatica, viaggiare verso il letto capillare di un sito secondario, estravasare nel tessuto secondario e proliferare o crescere fino a formare lesioni metastatiche5. L'uso di modelli murini è stato fondamentale per promuovere la comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della semina e della crescita metastatica6,7. Qui ci concentriamo sulle metastasi del cancro al seno, per le quali vengono spesso utilizzati sia modelli murini geneticamente modificati che metodi di trapianto, ognuno con la propria serie di vantaggi e limitazioni.
I modelli di tumore mammario geneticamente modificati fanno uso di promotori specifici della ghiandola mammaria, tra cui MMTV-LTR (mouse mammary tumor virus long terminal repeat) e WAP (Whey Acidic Protein), per guidare l'espressione dei transgeni nell'epitelio mammario8. Gli oncogeni tra cui l'antigene T medio del polioma (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 e il virus simian 40 (SV40) sono stati espressi in questo modo9,10,11,12,13, e mentre questi modelli genetici sono utili per studiare l'inizio e la progressione del tumore primario, pochi metastatizzano facilmente in organi distanti. Inoltre, questi modelli genetici murini sono spesso più proibitivi in termini di tempo e costi rispetto ai modelli di metastasi spontanee o sperimentali. Data la limitazione della maggior parte dei modelli di tumore mammario geneticamente modificati per studiare le metastasi, le tecniche di trapianto sono diventate metodi interessanti per studiare questo complesso processo. Ciò include l'iniezione ortotopica, della vena della coda, intracardiaca e intracranica di linee cellulari adatte.
Sebbene diverse linee cellulari di cancro al seno metastatizzino prontamente dopo l'iniezione ortotopica nel cuscinetto di grasso mammario14,15, la consistenza e la riproducibilità del carico tumorale metastatico può essere una sfida e la durata di tali studi può essere dell'ordine di diversi mesi. Per valutare le metastasi polmonari, in particolare, l'iniezione endovenosa nella vena della coda è spesso un metodo più riproducibile ed efficace nel tempo con diffusione metastatica che si verifica tipicamente nell'arco di poche settimane. Tuttavia, poiché il modello di iniezione endovenosa bypassa le fasi iniziali della cascata metastatica, è necessario prestare attenzione nell'interpretare i risultati di questi studi. In questa dimostrazione, mostriamo l'iniezione della vena caudale di cellule tumorali mammarie insieme a un metodo di analisi accurato e completo.
Anche se la comunità di ricerca ha compiuto progressi significativi nella comprensione del complesso processo delle metastasi del cancro al seno, si stima che oltre 150.000 donne abbiano attualmente il cancro al seno metastatico16. Di quelli con carcinoma mammario in stadio IV, >36% dei pazienti ha metastasi polmonari17; tuttavia, il modello sito-specifico e l'incidenza delle metastasi possono variare in base al sottotipo molecolare18,19,20,21. Le pazienti con metastasi polmonari associate al cancro al seno hanno una sopravvivenza mediana di soli 21 mesi, evidenziando la necessità di identificare trattamenti efficaci e nuovi biomarcatori per questa malattia17. L'uso di modelli sperimentali di metastasi, compresa l'iniezione endovenosa di cellule tumorali, continuerà a far progredire la nostra conoscenza di questa importante sfida clinica. Quando combinate con la patologia di imaging digitale e il metodo di analisi del carico tumorale polmonare metastatico descritto in questo protocollo, le iniezioni di vena caudale sono uno strumento prezioso per la ricerca sulle metastasi del cancro al seno.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>alcohol prep pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>for cleaning tail prior to injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>for mouse dissection and lung tissue inflation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT10013CV</td>
			<td>cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21030CV</td>
			<td>used for resuspending tumor cells for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol (70 % solution)</td>
			<td>OSU</td>
			<td></td>
			<td>used to minimize mouse&#39;s fur during dissection; use caution - flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evan&#39;s blue dye</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E2129</td>
			<td>used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>cell culture media additive; used at 10% in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-270</td>
			<td>for dissection and lung tissue inflation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/NJ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001800</td>
			<td>syngeneic mouse strain for MVT1 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemacytometer (Bright-Line)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>for use in cell culture to obtain cell counts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin syringe (28 G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-1B</td>
			<td>for tail-vein injections (BD 329424)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>human breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVT1 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mouse mammary tumor cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needles (26 G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-15</td>
			<td>used to inflate the mouse&#39;s lungs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>245685</td>
			<td>used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005557</td>
			<td>maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin 100x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140163</td>
			<td>cell culture media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile gauze</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9379092</td>
			<td>for applying pressue to mouse&#39;s tail if bleeding occurs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-458</td>
			<td>used to inflate mouse lung tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tail-vein restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>TV-150 STD</td>
			<td>used to restrain mouse for tail-vein injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue (0.4 %)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>used in cell culture to assess viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25 %</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200-114</td>
			<td>used in cell culture to detach tumor cells from plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells

Le metastasi, la causa principale di morbilità e mortalità per la maggior parte dei malati di cancro, possono essere difficili da modellare preclinicamente nei topi. Sono disponibili pochi modelli di metastasi spontanee. Pertanto, il modello sperimentale di metastasi che coinvolge l'iniezione della vena caudale di linee cellulari adatte è un pilastro della ricerca sulle metastasi. Quando le cellule tumorali vengono iniettate nella vena laterale della coda, il polmone è il loro sito preferito di colonizzazione. Una potenziale limitazione di questa tecnica è la quantificazione accurata del carico tumorale polmonare metastatico. Mentre alcuni ricercatori contano macrometastasi di dimensioni predefinite e/o includono micrometastasi dopo il sezionamento del tessuto, altri determinano l'area delle lesioni metastatiche rispetto all'area tissutale normale. Entrambi questi metodi di quantificazione possono essere estremamente difficili quando il carico metastatico è elevato. Qui, dimostriamo un modello di iniezione endovenosa di metastasi polmonari seguito da un metodo avanzato per quantificare il carico tumorale metastatico utilizzando un software di analisi delle immagini. Questo processo consente di studiare più parametri end-point, tra cui la dimensione media delle metastasi, il numero totale di metastasi e l'area totale delle metastasi, per fornire un'analisi completa. Inoltre, questo metodo è stato esaminato da un patologo veterinario certificato dall'American College of Veterinary Pathologists (SEK) per garantire l'accuratezza.

Se si utilizzano cellule non etichettate per l'iniezione della vena della coda, può essere difficile confermare la colonizzazione polmonare fino a (1) il tempo dell'autopsia se si possono osservare macrometastasi o (2) dopo l'analisi istologica se esistono metastasi microscopiche. Con un ampio carico di tumore polmonare metastatico, i topi avranno faticato a respirare. Come con qualsiasi studio sul tumore, i topi devono essere attentamente monitorati per tutta la durata dello studio. L'uso di cellule marcate è un modo ...

Watch this Scientific Journal Video about Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells at JoVE.com

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

L'iniezione endovenosa di cellule tumorali viene spesso utilizzata nella ricerca sulle metastasi, ma il carico tumorale metastatico può essere difficile da analizzare. Qui, dimostriamo un modello di iniezione della vena caudale di metastasi e includiamo un nuovo approccio per analizzare il carico tumorale polmonare metastatico risultante.

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.6K Views.  The Ohio State University Medical Center. L'iniezione endovenosa di cellule tumorali viene spesso utilizzata nella ricerca sulle metastasi, ma il carico tumorale metastatico può essere difficile da analizzare. Qui, dimostriamo un modello di iniezione della vena caudale di metastasi e includiamo un nuovo approccio per analizzare il carico tumorale polmonare metastatico risultante.

Video: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Analisi di reclutamento delle cellule di tumore del polmone

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. Recently, impressive advances in novel therapies have dramatically prolonged survival and improved quality of life for many cancer patients. Sadly, incidence of brain metastatic recurrences is fast rising, and all current therapies are merely palliative. Hence, good experimental animal models are urgently needed to facilitate in-depth studies of the disease biology and to assess novel therapeutic regimens for preclinical evaluation. However, the standard in vivo metastasis assay via tail vein injection of cancer cells produces predominantly lung metastatic lesions; animals usually succumb to the lung tumor burden before any meaningful outgrowth of brain metastasis. Intracardiac injection of tumor cells produces metastatic lesions to multiple organ sites including the brain; however, the variability of tumor growth produced with this model is large, dampening its utility in evaluating therapeutic efficacy. To generate reliable and consistent animal models for brain metastasis study, here we describe a procedure for producing experimental brain metastasis in the house mouse (Mus musculus) via intracarotid injection of tumor cells. This approach allows one to produce large number of brain metastasis-bearing mice with similar growth and mortality characteristics, thus facilitating research efforts to study basic biological mechanisms and to assess novel therapeutic agents.

Brain metastasis has become an urgent unmet medical need as its incidence has increased while therapeutic options have remained palliative. Creating experimental animal models of brain metastasis via intracarotid arterial injection of cancer cells facilitates mechanistic studies of the disease biology and evaluation of novel intervention regimens.

Intracarotidea Cancer Cell iniezione per produrre modelli murini di cervello Metastasi

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

Modello del polmone acellulare e cellulari per lo studio di metastasi del tumore

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

Utilizzo dell'analisi delle immagini basata su computer per migliorare la quantificazione della metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are diagnosed with brain metastases each year. Significant progress has been made in improving survival outcomes for patients with primary breast cancer and systemic malignancies; however, the dismal prognosis for patients with clinical brain metastases highlights the urgent need to develop novel therapeutic agents and strategies against this deadly disease. The lack of suitable experimental models has been one of the major hurdles impeding advancement of our understanding of brain metastasis biology and treatment. Herein, we describe a xenograft mouse model of brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified cell line derived from inflammatory breast cancer (IBC), a rare and aggressive form of breast cancer. Cells were labeled with firefly luciferase and green fluorescence protein to monitor brain metastasis, and quantified metastatic burden by bioluminescence imaging, fluorescent stereomicroscopy, and histologic evaluation. Mice robustly and consistently develop brain metastases, allowing investigation of key mediators in the metastatic process and the development of preclinical testing of new treatment strategies.

We describe a xenograft mouse model of breast cancer brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified inflammatory breast cancer cell line.

Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the tumor microenvironment, play a crucial role in metastatic CRC progression and predict poor patient prognosis. However, there is a lack of satisfactory mouse models to study the crosstalk between metastatic cancer cells and CAFs. Here, we present a method to investigate how liver metastasis progression is regulated by the metastatic niche and possibly could be restrained by stroma-directed therapy. Portal vein injection of CRC organoids generated a desmoplastic reaction, which faithfully recapitulated the fibroblast-rich histology of human CRC liver metastases. This model was tissue-specific with a higher tumor burden in the liver when compared to an intra-splenic injection model, simplifying mouse survival analyses. By injecting luciferase-expressing tumor organoids, tumor growth kinetics could be monitored by in vivo imaging. Moreover, this preclinical model provides a useful platform to assess the efficacy of therapeutics targeting the tumor mesenchyme. We describe methods to examine whether adeno-associated virus-mediated delivery of a tumor-inhibiting stromal gene to hepatocytes could remodel the tumor microenvironment and improve mouse survival. This approach enables the development and assessment of novel therapeutic strategies to inhibit hepatic metastasis of CRC.

Portal vein injection of colorectal cancer (CRC) organoids generates stroma-rich liver metastasis. This mouse model of CRC hepatic metastasis represents a useful tool to study tumor-stroma interactions and develop novel stroma-directed therapeutics such as adeno-associated virus-mediated gene therapies.

Iniezione di vena porta di organoidi del cancro del colon-retto per studiare le metastasi epatiche Stroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...