Name: chromatographic fingerprinting by template matching for data collected by comprehensive two-dimensional gas chromatography
Uploaded: 2020-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatographic Fingerprinting by Template Matching for Data Collected by Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography at JoVE.com

La ricerca è stata sostenuta da Progetto Ager − Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare. Acronimo di progetto Violin - Valorizzazione degli olivi italiani attraverso strumenti analitici innovativi (https://olivoeolio.progettoager.it/index.php/i-progetti-olio-e-olivo/violin-valorization-of-italian-olive-products-through-innovative-analytical-tools/violin-il-progetto). Il software GC Image è disponibile per una prova gratuita per i lettori che desiderano dimostrare e testare il protocollo.

1. Importazione di dati grezzi
NOTA: in questo modo viene creata una matrice raster bidimensionale per la visualizzazione e l'elaborazione.
<ol><li>Avviare il software di immagine.</li>
	<li>Selezionare File | Importazioni; passare al file di dati grezzi acquisito dal sistema GC×GC-TOF MS denominato "VIOLIN 101.lsc" (File aggiuntivo 1); quindi, fare clic su Apri. Il cromatogramma si apre in questo software. NOTA: il formato del file di dati grezzi dipende dal produttore dello strumento. Il software importa una varietà di formati di file elencati nella guida dell'utente.</li>
	<li>Nella finestra di dialogo Importa impostare il periodo di modulazione (PM) su 3,5 s; quindi fare clic su OK. NOTA: alcuni software di acquisizione potrebbero non registrare il periodo di modulazione.</li>
	<li>Selezionare File | Salvare l'immagine con nome; passare alla cartella desiderata; immettere il nome "Olio 1 RAW.gci" (File complementare 2); quindi fare clic su Salva.</li>
</ol>2. Spostare la fase di modulazione
NOTA: in questo modo tutti i picchi di ogni ciclo di modulazione entrano nella stessa colonna di immagine, inclusi i picchi che avvolgono intorno alla fine del periodo di modulazione nel tempo vuoto del successivo periodo dimodulazione 20.
<ol><li>Selezionare Elaborazione | Fase di spostamento.</li>
	<li>Nella finestra di dialogo Fase di spostamento impostare l'importo del turno su -0,8 s; quindi fare clic su OK.</li>
</ol>3. Correzione di base21
<ol><li>Selezionare grafica | Disegnare rettangolo.</li>
	<li>Fare clic e trascinare per disegnare un rettangolo nell'immagine in cui non vengono rilevati picchi.</li>
	<li>Selezionare Strumenti | Visualizzare i dati; notare la deviazione media e standard del segnale del rivelatore, qui, 21.850 ± 1.455 SD numero digitale senza unità (DN); quindi, chiudere lo strumento.</li>
	<li>Selezionare Elaborazione | Previsione corretta.</li>
</ol>4. Colorare l'immagine cromatografica utilizzando una mappa dei valori e una mappa dei colori20
<ol><li>Selezionare Visualizza | Colorizzare.</li>
	<li>Nella finestra di dialogo Colorizza selezionare la scheda Importa/Esporta; selezionare la #AAAA di coloripersonalizzata (File complementare 3)fornita come materiale supplementare; quindi fare clic su Importa.</li>
	<li>Nei controlli Mapping valori impostare l'intervallo di valori sui valori minimo e massimo; quindi fare clic su OK.</li>
</ol>5. 2picchi D (ad esempio, blob) rilevamento per aliti18
<ol><li>Selezionare Elaborazione | Rilevare blob con le impostazioni predefinite; quindi, osservare che alcuni picchi sono divisi e ci sono rilevamenti spuri.</li>
	<li>Selezionare Configura | Impostazioni | Rilevamento BLOB; quindi impostate Smussatura su 0,1 per la prima quota e 2,0 per la seconda dimensione e impostate volume minimo (cioè soglia per i valori sommati) su 1,00 E6; quindi fare clic su OK.</li>
	<li>Selezionare Elaborazione | Rilevare blob con le nuove impostazioni; quindi, osservare i miglioramenti.</li>
</ol>6. Filtrazione dei picchi 2D
NOTA: Questo viene fatto per rimuovere automaticamente i rilevamenti senza senso a causa di sanguinamenti di colonna lungo l'1D e colpi o code lungo il 2D.
<ol><li>Selezionare Elaborazione | Rilevamento blob interattivo.</li>
	<li>Prendere nota delle impostazioni di rilevamento BLOB; quindi, fare clic su Rileva.</li>
	<li>Nel generatore di filtri avanzati fare clic su Aggiungi; Nella finestra di dialogo Nuovo vincolo selezionare Conservazione II; quindi fare clic su OK.</li>
	<li>Nei dispositivi di scorrimento Vincolo impostare i tempi di conservazione minimo e massimo 2D per il filtro per ridurre il numero di falsi picchi senza perdere picchi veri.</li>
	<li>Fare clic su Applica; quindi, fare clic su Sì per salvare le impostazioni di rilevamento con il nuovo filtro. NOTA: Potrebbero essere necessari strumenti più avanzati per affrontare particolari problemi di rilevamento, come il rilevamento dei picchi ionico o la deconvoluzione per le co-eluizioni19.</li>
</ol>7. Calibrazione lineare degli indici di ritenzione
NOTA: eseguire questo passaggio22 (IT) per i tempi di conservazione specifici nell'insieme di standard ri (retention index) (in genere n-alcani).
<ol><li>Selezionare Configura | Tabella RI | Indice di conservazione (Col I).</li>
	<li>Nella finestra di dialogo Configurazione tabella RI fare clic su Importa; selezionare quindi il file di calibrazione RI (in formato CSV con nome, tempo di conservazione e indice di conservazione) denominato "Tabella LRI.csv" – (File aggiuntivo 4).</li>
	<li>Selezionare File | Salvare l'immagine A. Passare alla cartella desiderata; immettere il nome "Olio 1 LRI CALIBRATO.gci" (File complementare 5); quindi fare clic su Salva.</li>
</ol>8. Ricerca degli spettri di picco nella libreria MS NIST1723
<ol><li>Selezionare Configura | Impostazioni | Libreria di ricerca.</li>
	<li>Nella finestra di dialogo Libreria di ricerca impostare Type of Spectrum su Peak MS, Intensity Threshold su 100, NIST Search Type su Simple (Similarity), NIST RI Column Type su Standard Polar e NIST RI Tolerance su 10; quindi fare clic su OK. NIST MS Search offre molte altre impostazioni impostate sulle impostazioni predefinite qui.</li>
	<li>Selezionare Elaborazione | Libreria di ricerca per tutti i BLOB.</li>
</ol>9. Rivedere e correggere le identificazioni degli aliti
<ol><li>Nella tavolozza degli strumenti impostare la modalità cursore su Blob | Selezionare Blob.</li>
	<li>Nella visualizzazione Immagine fare clic con il pulsante destro del mouse sul picco desiderato.</li>
	<li>Nella finestra di dialogo Proprietà BLOB esaminare le proprietà BLOB; quindi, fare clic su Hit List.</li>
	<li>Ispezionare la hit list; quindi, se l'identificazione non è corretta, selezionare il segno di spunta accanto all'identificazione corretta.</li>
	<li>Nella finestra di dialogo Proprietà BLOB immettere il nome del gruppo per designare la classe chimica e tutti gli altri metadati desiderati; quindi fare clic su OK.</li>
	<li>Selezionare File | Salvare l'immagine con nome; passare alla cartella desiderata; immettere il nome "Olio 1 COLORIZZATO per Template construction.gci" (File complementare 6); quindi fare clic su Salva. NOTA: Questo file è incluso nell'archivio supplementare, che può essere aperto per il passaggio 10.</li>
</ol>10. Creare un modello con picchi mirati15
<ol><li>Nella visualizzazione Immagine (ancora in modalità Seleziona BLOB dal passaggio 9.1), selezionare i picchi desiderati con un clic sul primo picco e CTRL + fare clic sui picchi aggiuntivi.</li>
	<li>Nella tavolozza degli strumenti fare clic sul pulsante Aggiungi a modello.</li>
	<li>Al termine del modello, selezionare File | Salva modello; specificare la cartella e il nome del file; quindi fare clic su Salva.</li>
	<li>Selezionare File | Chiudi immagine. NOTA: a questo punto, queste istruzioni continuano con il modello creato per includere i picchi di destinazione desiderati, disponibili come "Targeted tamplate.bt" (File aggiuntivo 7).</li>
</ol>11. Abbinare e applicare il modello
NOTA: la corrispondenza riconosce il modello di modello nei picchi rilevati di un nuovo cromatogramma. Applicazione delle identificazioni dei set corrispondenti e di altri metadati nel nuovo cromatogramma dal modello.
<ol><li>Selezionare File | Apri immagine; passare al file cromatogramma "Oil 2 COLORIZED.gci" (File supplementare 8), che viene pre-elaborato; quindi, fare clic su Apri.</li>
	<li>Nella tavolozza degli strumenti impostare la modalità cursore su Template | Selezionare Oggetti.</li>
	<li>Selezionare Modello | Modello di caricamento.</li>
	<li>Nella finestra di dialogo Carica modello fare clic su Sfoglia; passare al modello di picchi di destinazione "Targeted template.bt" ( SupplementaryFile 7); quindi, fare clic su Apri.</li>
	<li>Nella finestra di dialogo Carica modello fare clic su Caricae quindi su Ignora.</li>
	<li>Nella visualizzazione Immagine fare clic con il pulsante destro del mouse su un picco di modello; quindi, ispezionare le relative proprietà dell'oggetto, incluso il qCLIC e l'MS di riferimento.</li>
	<li>Selezionare Modello | Modello interattivo di corrispondenza e trasformazione.</li>
	<li>Nell'interfaccia Corrispondenza interattiva fare clic su Corrispondenza tutto; quindi, esaminare i risultati corrispondenti sia nella tabella che nell'immagine, in cui ogni picco del modello è contrassegnato da cerchi non riempiti e, se viene effettuata una corrispondenza, esiste un collegamento a un cerchio riempito per il picco rilevato.</li>
	<li>Modificate le corrispondenze come desiderato; una volta soddisfatti, fare clic su Applica per trasferire metadati dal modello al cromatogramma. NOTA: i vincoli corrispondenti, ad esempio qCLIC, aiutano a corrispondere al modello corretto tra i picchi rilevati del nuovo cromatogramma. I parametri di vincolo includono il tipo di firma MS utilizzata come riferimento al modello (MS di picco o MS BLOB) e i valori di soglia per la somiglianza spettrale (DMF (Direct Match Factor) e Reverse Match Factor (RMF)). Qui, i parametri sono impostati sulla base distudi precedenti 13,14 per limitare le corrispondenze false negative: picco MS e DMF e soglia di somiglianza RMF 700.</li>
</ol>12. Trasforma il modello per una cromatografia sostanzialmente diversa
NOTA: Questo passaggio non è necessario a meno che le condizioni cromatografiche non varino sostanzialmente causando un disallineamento del modello con un nuovo cromatogramma, come può essere il caso negli studi a lungo termine o dopo l'installazione di una nuova colonna. In questi casi, il modello può essere trasformato geometricamente nel piano cromatografico dei tempi di ritenzione per adattarsi meglio al nuovo cromatogramma12,13. In questo esempio, i modelli di picco del modello e del cromatogramma sono simili, ma differiscono nella geometria dei tempi di ritenzione, ad esempio per condizioni cromatografiche diverse.
<ol><li>Ripetere i passaggi da 11.2 a 11.5, ad eccezione di passare a, selezionare e caricare il modello di destinazione 2.bt ( Fileaggiuntivo 9).</li>
	<li>Selezionare Modello | Modello di corrispondenza interattivo; quindi, fare clic su Modifica trasformazione.</li>
	<li>Nell'interfaccia Trasforma modello variare le scale, le traduzioni e le cesoie 1D e 2D per allineare meglio il modello ai picchi rilevati; quindi fare clic su Trasforma modello.</li>
	<li>Con il modello trasformato, fare clic su Modifica corrispondenza; quindi, ripetere i passaggi 11.8–11.9.</li>
</ol>13. Eseguire analisi combinate non mirate e mirate su una serie di cromatogrammi
NOTA: un modello combinato non mirato e mirato (UT), noto anche come modello di funzionalità 24,25,se abbinato a ciascuno di un insieme di cromatogrammi, stabilisce corrispondenze tra alyti non mirati e mirati, quindi vengono estratte funzionalità di campionamento incrociato coerenti per il riconoscimento dei pattern.
<ol><li>Eseguire la pre-elaborazione (passaggi da 1 a 6) e la corrispondenza dei modelli UT (passaggi 11.1-11.9) per tutti i cromatogrammi nel set (ad esempio, cromatogrammi 2D di oli). In alternativa, automatizzare questo passaggio con software di progetto o software simile, non descritto qui.</li>
	<li>Avviare il software Investigator.</li>
	<li>Selezionare File | Analisi aperta; quindi, selezionare e aprire "Feature Jove su 70 eV.gca" (File supplementare 10).</li>
	<li>Fare clic su OK per aprire ed esaminare i risultati.</li>
	<li>Fare clic sulla scheda Composti per esaminare i valori metrici e le statistiche per aaliti specifici (ad esempio, aliti mirati con nomi chimici associati) o aaliti non mirati con identificatori (#) allineati su tutti i cromatogrammi, quindi eseguire i passaggi seguenti.<ol>
<li>Fare clic sulla scheda Attributi per esaminare i valori e le statistiche per metriche specifiche tra i cromatogrammi.</li>
		<li>Fare clic sulla scheda Riepilogo per esaminare le statistiche di riepilogo sia per i composti che per le funzionalità. Se i cromatogrammi provengono da classi diverse, come in questo caso gli oli prodotti da olive raccolte in due diverse regioni d'Italia, la scheda Riepilogo elenca le statistiche del rapporto Fisher (F e FDR), che forniscono approfondimenti sulle caratteristiche per discriminare tra le classi.</li>
		<li>Visualizzare vari grafici in tutte le schede e, se lo si desidera, eseguire Analisi componenti principali (PCA) nella scheda Attributi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>14. Modificare il modello UT per l'analisi MS parallela
NOTA: L'analisi è stata eseguita con energie di ionizzazione elettronica sia 70 eV che 12 eV (cioè alte e basse) energie di ionizzazioneelettronica 26,27.
<ol><li>Aprire uno dei 12 cromatogrammi eV, ad esempio "Olio 1 12 eV RAW.gci" (File supplementare 11),eseguire la pre-elaborazione (passaggi da 1 a 6) e caricare il modello UT "modello UT 70 relaxed.bt" (File supplementare 12) come descritto nei passaggi 11.1-11.6. I file sono forniti come materiale supplementare.</li>
	<li>Se necessario, regolare il modello in base ai 12 picchi di eV rilevati come descritto nel passaggio 12. Qui, non c'è un disallineamento significativo perché i segnali tandem sono multiplexati. Tuttavia, va notato che poiché le diverse impostazioni di ionizzazione producono diverse frammentazioni, è necessario allentare i vincoli per i vincoli qCLIC sulla somiglianza spettrale DMF e RMF (non dimostrata qui).</li>
	<li>Selezionare File | Salva modello; specificare la cartella e il nome del file, ad esempio "Modello UT 12.bt" (File complementare 13); quindi fare clic su Salva.</li>
</ol>15. Eseguire analisi combinate non mirate e mirate su 12 cromatogrammi eV
<ol><li>Selezionare File | Analisi aperta; quindi selezionare e aprire "Feature Jove su 12 eV.gca" - File supplementare 14 fornito.</li>
	<li>Fare clic su OK per aprire ed esaminare i risultati.</li>
	<li>Fare clic sulla scheda Composti per esaminare i valori metrici, fare riferimento a 12 risposte eV e statistiche per aaliti specifici (ad esempio, aliti mirati con nomi chimici associati) o aaliti non mirati con identificatori (#) allineati su tutti i cromatogrammi, quindi eseguire i passaggi seguenti.<ol>
<li>Fare clic sulla scheda Attributi per esaminare i valori e le statistiche per metriche specifiche tra i cromatogrammi.</li>
		<li>Fare clic sulla scheda Riepilogo per esaminare le statistiche di riepilogo sia per i composti che per le funzionalità a 12 eV. Se i cromatogrammi provengono da classi diverse, come in questo caso gli oli prodotti da olive raccolte in due diverse regioni d'Italia, la scheda Riepilogo elenca le statistiche del rapporto Fisher (F e FDR), che forniscono approfondimenti sulle caratteristiche per discriminare tra le classi.</li>
		<li>Visualizzare i vari grafici disponibili in tutte le schede e, se lo si desidera, eseguire Analisi componenti principali (PCA) nella scheda Attributi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Stephen E. Reichenbach e Qingping Tao hanno interessi finanziari in GC Image, LLC. La Dott.ssa Daniela Peroni è dipendente di SRA Instruments, distributore di GC Image in Italia e Francia. Il Dott. Federico Stilo, la Prof.ssa Chiara Cordero e il Prof.

La visualizzazione dei dati GC×GC-TOF MS è un passaggio fondamentale per un'adeguata comprensione dei risultati ottenuti da separazioni bidimensionali complete. I grafici di immagini con colorazione personalizzata consentono agli analisti di apprezzare le differenze di risposta del rivelatore e quindi la distribuzione differenziale dei componenti del campione. Questo approccio visivo cambia completamente la prospettiva degli analisti sull'interpretazione e l'elaborazione dei cromatogrammi. Questo primo passo, una volta compreso e utilizzato con sicurezza dai cromatografi, apre una nuova prospettiva nell'ulteriore elaborazione.
Un altro aspetto fondamentale dell'elaborazione dei dati è l'accessibilità alla matrice di dati completa (cioè dati spettrali MS e risposte) per tutti i punti campione, ognuno dei quali corrisponde a un singolo evento rivelatore. A questo proposito, 2D raggiunge il picco di integrazione, in modo che la raccolta di eventi rivelatori corrispondenti a un singolo alita rappresenti un passo critico. Nel protocollo attuale, il rilevamento dei picchi 2Dsi basa sull'algoritmospartiacque 18 con alcuni adattamenti inclusi per migliorare la sensibilità di rilevamento in caso di composti co-eluizzanti parziali. Per rendere questo processo più specifico, è necessario effettuare la deconvoluzione e adottare procedure più sofisticate. Ciò è possibile eseguendo un rilevamento del picco ionici per i dati MS; l'algoritmo elabora la matrice di dati e isola la risposta da singoli aliti in base ai profilispettrali 19,31.
Un passaggio importante ma critico del protocollo e di qualsiasi processo di interpretazione dei dati GC×GC-MS, riguarda l'identificazione degli aaliti. Questa procedura, proposta nelle fasi 8 e 9, in assenza di un'analisi di conferma con standard autentici, deve essere condotta con attenzione dall'analista. Le azioni automatizzate sono disponibili in qualsiasi software commerciale; includono la valutazione della somiglianza della firma spettrale MS rispetto agli spettri di riferimento raccolti (cioè le librerie spettrali) e la valutazione dei rapporti caratteristici tra gli ioni qualificatore/quantificatore. Tuttavia, sono necessari ulteriori criteri di conferma per disambiguare l'identificazione degli isomeri. Il protocollo propone l'adozione di indici di conservazione lineare per dare priorità all'elenco dei candidati; il limite qui riguarda la disponibilità dei dati di conservazione e la loro coerenza.
La caratteristica principale che rende unico questo approccio è la corrispondenza deimodelli 12,13,15,29. La corrispondenza dei modelli consente il riconoscimento del modello 2Din modo molto efficace, specifico e intuitivo. Può essere impostato, in termini di sensibilità e specificità, applicando valori soglia personalizzati e/o funzioni di vincolo mentre l'analista può supervisionare la procedura interagendo attivamente con i parametri della funzione di trasformazione. La particolarità di questo processo si basa sulla possibilità di incrociare le informazioni sui picchi mirati e non mirati tra campioni di un lotto uniforme ma anche tra campioni acquisiti con le stesse condizioni nominali nonostante il disallineamento medio-grave. I vantaggi di questa operazione riguardano la possibilità di preservare tutte le identificazioni degli aaliti mirati, che è un'attività dispendiosa in termini di tempo per l'analista, e tutti i metadati salvati per picchi mirati e non mirati dalle sessioni di elaborazione precedenti.
La corrispondenza dei modelli è anche molto efficace in termini di tempo computazionale; I file di dati MS a bassa risoluzione sono costituiti da circa 1-2 Gb di dati imballati, mentre le analisi MS ad alta risoluzione possono raggiungere i 10-15 Gb per singola esecuzione analitica. La corrispondenza dei modelli non elabora ogni volta la matrice di dati completa, ma, all'inizio, esegue l'allineamento del tempo di conservazione tra i cromatogrammi utilizzando i picchi dei modelli, quindi elabora i picchi dei candidati all'interno della finestra di ricerca per la corrispondenza di somiglianza con il riferimento nel modello. In caso di grave disallineamento, la situazione più impegnativa, le trasformazioni polinomiali globali di secondo ordine hanno funzionato meglio dei metodi locali riducendo al contempo il tempo computazionale13.
Affinché la tecnica GC×GC si diffonda ampiamente oltre il mondo accademico e i laboratori di ricerca, gli strumenti di elaborazione dei dati devono facilitare le operazioni di base per la visualizzazione e l'ispezione dei cromatogrammi; l'identificazione degli aaliti dovrebbe offrire la possibilità di adottare algoritmi e procedure standardizzati (ad esempio, algoritmo di ricerca NIST e calibrazione IT); e l'analisi comparativa dovrebbe essere intuitiva, efficace e supportata da strumenti interattivi. L'approccio proposto risponde a queste esigenze offrendo al contempo opzioni e strumenti avanzati per affrontare situazioni complesse come la co-eluizione degli aliti, la calibrazione di aliti multipli, l'analisi di tipo gruppo e l'allineamento del rilevamento parallelo.
La letteratura referenziata copre bene molti possibili scenari in cui GC×GC e, più in generale, cromatografia bidimensionale completa, offrono soluzioni uniche e risultati affidabili che non possono essere raggiunti da 1cromatografia D nell'analisi a esecuzione singola. 5,32,33 Sebbene GC×GC sia lo strumento più potente che aumenta la capacità di separazione e la sensibilità, ci sono sempre limitazioni alla potenza di separazione, alla sensibilità e ad altre capacità sistemiche. Con l'avvicinarsi di questi limiti sistemici, l'analisi dei dati diventa progressivamente più difficile. Pertanto, la ricerca e lo sviluppo devono continuare a migliorare gli strumenti analitici a nostra disposizione.

La gascromatografia bidimensionale completa combinata con il rilevamento spettrometrico di massa a tempo di volo (GC×GC-TOF MS) è oggi l'approccio analitico più informativo per la caratterizzazionechimica di campioni complessi 1,2,3,4,5. In GC×GC, le colonne sono collegate in serie e interfacciate da un modulatore (ad esempio, un'interfaccia di messa a fuoco termica o basata su valvole) che intrappola i componenti di eluizione dalla prima colonna di dimensione(1D) prima della loro reiezione nella colonna della seconda dimensione(2D). Questa operazione viene eseguita entro un periodo di tempo di modulazione fisso (PM), generalmente compreso tra 0,5 e 8 s. Con la modulazione termica, il processo include la crio-intrappolamento e la messa a fuoco della banda di eluizione con alcuni vantaggi per la potenza di separazione complessiva.
Sebbene GC×GC sia una tecnica di separazione bidimensionale, il processo produce valori di dati sequenziali. Il convertitore analogico-digitale (A/D) del rivelatore ottiene l'uscita del segnale cromatografico ad una certa frequenza. Quindi, i dati vengono memorizzati in specifici formati proprietari che non solo contengono i dati digitalizzati ma anche i metadati correlati (informazioni sui dati). Il convertitore A/D impiegato nei sistemi GC×GC aiuta a mappare l'intensità del segnale cromatografico a un numero digitale (DN) in funzione del tempo nelle due dimensioni analitiche. I rivelatori a canale singolo (ad esempio, rivelatore di ionizzazione di fiamma (FID), rivelatore di cattura elettronica (ECD), rivelatore di chemiluminescenza dello zolfo (SCD), ecc.) producono valori singoli per tempo di campionamento, mentre i rivelatori multicanale (ad esempio, rivelatore spettrometrico di massa (MS)) producono valori multipli (tipicamente, su un intervallo spettrale) per tempo di campionamento lungo la corsa analitica.
Per visualizzare i dati 2D,l'elaborazione inizia con la rasterizzazione di un singolo periodo di modulazione (o ciclo) dei valori di dati come colonna di pixel (elementi immagine corrispondenti agli eventi del rivelatore). Lungo l'ordinata (asse Y, dal basso verso l'alto) viene visualizzato il tempo di separazione 2D. Le colonne pixel vengono elaborate in sequenza in modo che l'ascissa (asse X, da sinistra a destra) rapporti 1 tempodi separazione D. Questo ordinamento presenta i dati 2Din un sistema di coordinate cartesiano destrorso, con l'ordinale diconservazione 1 D come primo indice nell'array.
L'elaborazione dei dati dei cromatogrammi 2Dconsente di accedere a un livello di informazioni più elevato rispetto ai dati grezzi, consentendo il rilevamento dei picchi 2D,l'identificazione dei picchi, l'estrazione dei dati di risposta per l'analisi quantitativa e l'analisi comparativa incrociata.
I modelli di picco 2Dpossono essere trattati come l'impronta digitale unica del campione e i composti rilevati come caratteristiche minuzie per un'efficace analisi comparativa incrociata. Questo approccio, noto come fingerprinting basato su modelli6,7,è stato ispirato dal rilevamento biometrico delle improntedigitali 6. I sistemi automatici di verifica biometrica delle impronte digitali, infatti, si basano su caratteristiche uniche della punta delle dita: biforcazioni e finali di cresta, localizzate ed estratte da impressioni inchiostrate o immagini dettagliate. Queste caratteristiche, denominate funzionalità delle minuzie, vengono quindi abbinate ai modelli memorizzatidisponibili 8,9.
Come accennato in precedenza, ogni modello di × GC×GC è composto da picchi 2D distribuiti razionalmente su un piano bidimensionale. Ogni picco corrisponde a un singolo alyte, ha il suo potenziale informativo e può essere trattato come una singola caratteristica per l'analisi comparativa dei modelli.
Qui presentiamo un approccio efficace per il rilevamento delle impronte digitali chimiche da parte di GC×GC-TOF MS con ionizzazione tandem. L'obiettivo è catalogare in modo completo e quantitativo le funzionalità da un set di cromatogrammi.
Rispetto al software commerciale esistente o alle routine internamente10,11 cheutilizzano un approccio basato sulle funzionalità di picco, il fingerprinting basato su modelli è caratterizzato da un'elevata specificità, efficienza e tempo computazionale limitato. Inoltre, ha una flessibilità intrinseca che consente il cross-alignment delle caratteristiche di minuzia (cioè picchi 2D) tra cromatogrammi gravemente disallineati come quelli acquisiti da diversa strumentazione o in studi a lungo termine12,13,14.
Le operazioni di base del metodo proposto sono descritte brevemente per guidare il lettore verso una buona comprensione della complessità e del potere informativodel modello 2D. Quindi, esplorando la matrice di dati di uscita dello strumento, viene eseguita l'identificazione chimica e vengono conosciuti gli aliti mirati situati nello spazio bidimensionale. Il modello di picchi mirati viene quindi costruito e applicato a una serie di cromatogrammi acquisiti all'interno dello stesso lotto analitico. I metadati relativi ai tempi di conservazione, alle firme spettrali e alle risposte (assoluti e relativi) vengono estratti da modelli di picchi mirati ri-allineati e adottati per rivelare differenze compositive nel set di campioni.
Come ulteriore fase unica del processo, un rilevamento combinato delle impronte digitali non mirato e mirato (UT) viene eseguito anche su cromatogrammi pre-mirati per estendere il potenziale di rilevamento delle impronte digitali ad aaliti noti e sconosciuti. Il processo produce un modello UT per un'analisi comparativa davvero completa che può essere ampiamente automatizzata.
Come fase finale, il metodo esegue il cross-alignment delle caratteristiche in due segnali rivelatori paralleli prodotti con alte e basse energie di ionizzazione elettronica (70 e 12 eV).
Il protocollo è abbastanza flessibile nel supportare le analisi di un singolo cromatogramma o di un insieme di cromatogrammi e con cromatografia variabile e /o rivelatori multipli. Qui, il protocollo viene dimostrato con una suite software GC×GC disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) combinata con una libreria MS e un software di ricerca (vedere Table of Materials). Alcuni degli strumenti necessari sono disponibili in altri software e strumenti simili potrebbero essere implementati indipendentemente dalle descrizioni in letteratura di Reichenbach e colleghi15,16,17,18,19. I dati grezzi per la dimostrazione derivano da uno studio di ricerca sull'olio extravergine di oliva (EVO) condotto nel laboratorio degli autori14. In particolare, la frazione volatile (cioè volatilome) degli oli EVO italiani viene campiozzata per microesezione in fase solida headspace (HS-SPME) e analizzata da GC×GC-TOF MS per acquisire impronte diagnostiche per la qualità e la qualificazione sensoriale dei campioni. I dettagli sui campioni, le condizioni di campionamento e l'insieme analitico sono forniti nella tabella dei materiali.
I passaggi da 1 a 6 descrivono la pre-elaborazione dei cromatogrammi. I passaggi da 7 a 9 descrivono l'elaborazione e l'analisi dei singoli cromatogrammi. I passaggi da 10 a 12 descrivono la creazione e la corrispondenza dei modelli, che sono la base per l'analisi tra campioni. I passaggi da 13 a 16 descrivono l'applicazione del protocollo su un insieme di cromatogrammi, con i passaggi da 14 a 16 per l'analisi UT.

<table><tbody><tr><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m &amp;times; 0.25 mm dc &amp;times; 0.25 &amp;mu;m df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min.</td><td>Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia</td><td>PN 054796</td><td>Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40&amp;deg;C (2 min) to 240&amp;deg;C (10 min) at 3.5&amp;deg;C/min.</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m &amp;times; 0.1 mm dc &amp;times; 0.10 &amp;mu;m df) from .</td><td>Mega, Legnano, Milan, Italy</td><td>PN MEGA-1701</td><td></td></tr><tr><td>Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC</td><td>SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy</td><td>Project VIOLIN (Ager - Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare)</td><td></td><td>Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the &quot;Violin&quot; project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14</td></tr><tr><td>Gas chromatograph: Model 7890B GC</td><td>Agilent Technologies Wilmington DE, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC Image GC&amp;times;GC edition V 2.9</td><td>GC Image LLC, Lincoln, Nebraska</td><td></td><td>https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html</td></tr><tr><td>Image processing software</td><td>GC Image LLC, Lincoln, Nebraska</td><td></td><td>https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html</td></tr><tr><td>Mass spectrometer: BenchTOF-Select</td><td>Markes International Llantrisant, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6)</td><td>Merck-Millipore/Supelco</td><td>PN: 68982</td><td></td></tr><tr><td>Modulator controller: Optimode v2.0</td><td>SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modulator: KT 2004 loop type</td><td>Zoex Corporation Houston, TX, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3</td><td>National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD</td><td></td><td>https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-alkanes C8-C40 for retention indexing</td><td>Merck-Millipore/Supelco</td><td>PN: 40147-U</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv</td><td>Merck-Millipore/Supelco</td><td>PN: 100795</td><td></td></tr><tr><td>Solid Phase Microextraction fiber</td><td>Merck-Millipore/Supelco</td><td>PN 57914-U</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;- /&amp;beta;-thujone (CAS 546-80-5)</td><td>Merck-Millipore/Sigma Aldrich</td><td>PN: 04314</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatographic fingerprinting by template matching for data collected by comprehensive two-dimensional gas chromatography

L'elaborazione e la valutazione dei dati sono fasi critiche della gascromatografia bidimensionale completa (GCxGC), in particolare se accoppiate alla spettrometria di massa. Le informazioni dettagliate crittografate nei dati possono essere molto preziose ma di difficile accesso in modo efficiente. La densità e la complessità dei dati possono portare a lunghi tempi di elaborazione e richiedere procedure laboriose e dipendenti dagli analisti. Strumenti efficaci ma accessibili per l'elaborazione dei dati sono quindi fondamentali per consentire la diffusione e l'accettazione di questa tecnica multidimensionale avanzata nei laboratori per l'uso quotidiano. Il protocollo di analisi dei dati presentato in questo lavoro utilizza il rilevamento cromatografico delle impronte digitali e la corrispondenza dei modelli per raggiungere l'obiettivo di decostruzione altamente automatizzata di cromatogrammi bidimensionali complessi in singole caratteristiche chimiche per il riconoscimento avanzato di modelli informativi all'interno di singoli cromatogrammi e attraverso insiemi di cromatogrammi. Il protocollo offre elevata coerenza e affidabilità con poco intervento. Allo stesso tempo, la supervisione degli analisti è possibile in una varietà di impostazioni e funzioni di vincolo che possono essere personalizzate per fornire flessibilità e capacità di adattarsi alle diverse esigenze e obiettivi. La corrispondenza dei modelli è mostrata qui come un potente approccio per esplorare l'olio extravergine di oliva volatilome. Il cross-alignment dei picchi viene eseguito non solo per obiettivi noti, ma anche per composti non bersaglio, il che aumenta significativamente la potenza di caratterizzazione per una vasta gamma di applicazioni. Esempi sono presentati per la prova delle prestazioni per la classificazione e il confronto di modelli cromatografici da set di campioni analizzati in condizioni simili.

I modelli GC×GC-TOF MS di volatilome di olio extravergine di oliva di alta qualità mostrano circa 500 picchi 2D al di sopra di una soglia di rapporto segnale/rumore (SNR) di 100. Tale soglia è stata definita da precedenti indagini sulle sostanze alimentari volatili14,27 come il segnale relativo minimo oltre la soglia per ottenere spettri affidabili per l'analisi comparativa incrociata. I componenti sono distribuiti sullo spazio cromatografico in base alla loro relativa ritenzione nelle due dimensioni cromatografiche, e specificamente in base alla loro volatilità /polarità nell'1D e alla volatilità nel 2D. Qui, la combinazione di colonne è × semipolare (cioè Carbowax 20M × OV1701).
Il modello 2Dmostra un alto grado di ordine. I modelli di ritenzione relativa per serie e classi omologhe sono mostrati nella figura 1A con annotazioni (grafica per gruppi e bolle per picchi) per idrocarburi saturi lineari (nero), idrocarburi insaturi (giallo), aldeidi sature lineari (blu), aldeidi monoinsaturi (rosso), aldeidi polinsaturi (salmone), alcoli primari (verde) e acidi grassi a catena corta (cyano).
I picchi 2Drilevati possono quindi essere identificati confrontando lo spettro MS medio estratto dall'intero picco 2D(spettro blob) o dallo spettro più grande(spettro apice). La figura 2 illustra l'output della ricerca dello spettro apice per blob 5 e restituisce una corrispondenza ad alta somiglianza (primi 10 colpi) per (E)-2-exenal. I database esplorati sono quelli preselezione dall'analista nel passaggio 8 del metodo.
L'identificazione viene convalidata dall'indicizzazione della conservazione attiva. Il valore sperimentale IT è stato calcolato per i picchi 2D,in modo che in questa fase la ricerca della libreria dia la priorità ai risultati con valori coerenti di ITtabulato. Le finestre di tolleranza possono essere personalizzate in base all'esperienza degli analisti, all'affidabilità dei valori di database di riferimento in base alla fase stazionaria e alle condizioni analitiche applicate. Nuovi strumenti per la calibrazione intelligente degli indici di ritenzione lineare senza calibrazione sperimentale con n-alcani, sono stati recentemente sviluppati e discussi in uno studio di Reichenbach et al19. 
La raccolta dei picchi identificati 2D(cioè picchi mirati) può essere adottata per costruire un modello di picchi mirati per stabilire prontamente corrispondenze affidabili tra lo stesso composto in tutti i cromatogrammi campione. L'insieme dei picchi di modelli di destinazione viene visualizzato nella figura 1B. I cerchi rossi corrispondono ai 196 composti mirati, inclusi due standard interni (IS) collegati ai picchi dei modelli con linee di connessione. L'IS viene utilizzato per la normalizzazione delle risposta e le linee di connessione consentono di visualizzare quale dell'IS incluso verrà adottato per normalizzare ogni risposta di picco/BLOB 2D.
Nella figura 1B, i cerchi riempiti indicano corrispondenze positive tra il picco del modello e il modello effettivo, mentre i cerchi vuoti sono per i picchi dei modelli per i quali la corrispondenza non è stata verificata. Le corrispondenze false negative possono essere limitate da un'appropriata selezione di parametri di soglia, spettri di riferimento e funzioni divincolo 13,14,18,19. Per modelli complessi con co-eluizioni multiple, le funzioni di rilevamento del picco ionico basate sulla deconvoluzione spettrale sono consigliabile e potrebbero essere un'opzionevalida 19. I metadati di picco del modello vengono visualizzati nel pannello ingrandito della figura 1B per (E)-2-exenal.
La specificità della corrispondenza dei modelli si basa sulla possibilità di applicare funzioni di vincolo che limitano la corrispondenza positiva a quei picchi candidati che, rientrando nella finestra di ricerca dell'algoritmo, hanno somiglianza spettrale MS al di sopra di una certa soglia. In questo caso, nella fase 11, le soglie di somiglianza23 sono state fissate a 700 secondo precedenti esperimenti volti a definire parametri ottimali che limitavano le corrispondenze false negative14. Le aree evidenziate delle proprietà di picco del modello nella figura 1B mostrano le informazioni sulla stringa di spettro MS di riferimento e sulla funzione di vincolo qCLIC (ad esempio, (Match("<ms>") >= 700.0) e (RMatch("<ms>") >= 700.0)).
Applicando il modello a tutti i cromatogrammi di un insieme, si potrebbero incontrare situazioni impegnative come nel caso di disallineamento parziale dei modelli. Ciò può essere dovuto a incongruenze di temperatura del forno, instabilità del flusso/pressione del gas portante o a causa di un intervento manuale sul sistema come nel caso della sostituzione della colonna o della sostituzione del loop-capillaremodulatore 14,28. La figura 3 mostra una situazione di disallineamento parziale tra il modello di destinazione e il cromatogramma effettivo. Per disallineamenti minimi, le trasformazioni interattive dei modelli (Figura 3, pannello di controllo) possono riposizionare i picchi dei modelli per una migliore vestibilità. Una volta riposizionato, il modello può essere abbinato per stabilire corrispondenze. Nell'esempio, i picchi del modello (Figura 3, passaggio 12 ) corrispondono correttamente al modello 2Deffettivo. In caso di gravi disallineamenti, non discussi qui, la ripetizione delle azioni di aggiornamento della trasformazione della corrispondenza può adattare iterativamente la posizione dei picchi del modello al modello di piccoeffettivo 12,13,14.
Qui, i picchi mirati (cioè gli aliti noti) forniscono circa il 40% del risultato cromatografico (196 picchi mirati di circa 500 picchi rilevabili in media). L'altro 60% dei composti, insieme alle informazioni che portano, non viene preso in considerazione in un'analisi mirata. Per rendere l'indagine davvero completa e coerente, dovrebbe essere stabilito anche un allineamento incrociato dei picchi 2Dnon mirati. La prima applicazione in cui la corrispondenza dei modelli è stata estesa a tutti gli aliti rilevabili ha affrontato il complesso volatilome di caffè tostato7. Questo processo è automatizzato con un software (ad esempio, Investigator), mostrato qui nei passaggi 14-15.
In questo processo, le immagini pre-mirate appartenenti al set di campioni in esame (20 campioni) vengono utilizzate per definire picchi affidabili incrociando tutti i modelli di immagine29. Successivamente, viene creato un cromatogramma composito da cui è possibile identificare picchi affidabili UT e regioni di picco (ad esempio, ingombro di picchi 2D) nel cosiddetto modello di funzionalità17.
Per le analisi acquisite a 70 eV, il processo ha determinato 144 picchi affidabili con affidabilitàrilassata 29,76 dei quali appartengono all'elenco dei picchi mirati. Sulla base di questi 144 picchi affidabili, il processo allinea tutti i cromatogrammi in modo coerente con i tempi medi di ritenzione dei picchi affidabili e quindi li combina per creare un cromatogramma composito. La figura 4 mostra un elenco di tutti i campioni etichettati in base alla regione di produzione dell'olio (a sinistra) e l'elenco dei picchi/volumi blob affidabili in ciascun campione (a destra).
Il modello di funzionalità non mirato è composto da picchi 2Dda aliti rilevati nel cromatogramma composito, mostrato nella figura 5A, che corrispondono al modello dei picchi affidabili (n = 168 – cerchi rossi per picchi mirati e cerchi verdi per picchi non mirati). Gli spettri di massa dei picchi compositi, così come i loro tempi di ritenzione, sono registrati nel modello di feature come mostrato per l'acetato di (Z)-3-exenolo nell'area allargata. Le regioni di picco sono mostrate nella figura 5B come grafica di colore rosso; sono invece definiti dai contorni di tutti i picchi 2Drilevati nel cromatogramma composito (n = 3578).
Quando il riconoscimento non supervisionato del modello da parte di Principal Component Analysis viene applicato alla distribuzione mirata dei picchi all'interno dei 20 campioni analizzati, gli oli siciliani e toscani si raggruppano separatamente suggerendo che le condizioni pedoclimatiche e il terroir hanno un impatto sulla prevalenza relativa delle sostanze volatili. I risultati sono riportati nella figura 6A e i risultati dell'APC derivanti dalla distribuzione affidabile dei picchi sono riportati nella figura 6B. I due approcci convalidano incrociatamente che gli oli provenienti da diverse aree geografiche hanno firme chimiche diverse, mentre sono mappate firme chimiche coerenti, siano essi composti mirati o non mirati, o entrambi.
Infine, il software consente un rapido ed efficace riabilitazione dei modelli attraverso canali di rilevamento paralleli. In questa applicazione, il rilineamento viene proposto per i segnali di ionizzazione tandem. La sorgente ioniche dei multiplex MS tra due energie di ionizzazione (cioè 70 e 12 eV) ad una frequenza di acquisizione di 50 Hz per canale30. I due modelli cromatografici risultanti sono strettamente allineati, mentre i dati spettrali (cioè le firme spettrali e le risposte) portano informazioni complementari con diversi intervallidinamici di risposta 26,27. I modelli allineati consentono di estrarrele feature (picchi 2D e regioni di picco) con ID univoci (ad esempio, nomi chimici per picchi mirati e numero di numerazione univoco per picchi non mirati e regioni di picco).
La corrispondenza dei modelli consente un allineamento incrociato efficace. In questa situazione, non c'è molto disallineamento, ma i vincoli MS devono essere allentati per consentire corrispondenze per i picchi UT. D'altra parte, le regioni di picco UT in primo piano, che non hanno vincoli MS, vengono prontamente abbinate senza false corrispondenze negative. La figura 5C mostra un'area ingrandita di un cromatogramma da 12 eV in cui viene abbinato il modello di funzionalità creato da 70 dati eV. I picchi UT affidabili sono positivamente abbinati a causa dei vincoli qCLIC abbassati (ad esempio, soglia DMF a 600). Da notare, a 12 eV, ci sono meno picchi rilevati a causa della limitata frammentazione indotta da una bassa energia di ionizzazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61529/61529fig01.jpg"> Figura 1: Plot di contorno bidimensionale e modello di destinazione. (A) Appezzamento di contorno della frazione volatile di un olio extravergine di oliva toscano. I modelli ordinati di serie e classi omologhe sono evidenziati con diversi colori e linee: idrocarburi saturi lineari (linea nera e contorni 2D) idrocarburi insaturi (giallo), aldeidi sature lineari (blu) aldeidi monoinsaturi (rosso), aldeidi polinsaturi (salmone), alcoli primari (verde) e acidi grassi a catena corta (ciano). (B) Modello mirato sovrapposto di aaliti noti (cerchi di colore rosso) con linee di connessione che collegano gli standard interni (IS). I pannelli mostrano i metadati delle proprietà di picco/BLOB 2D (Decanal) o le proprietà di picco del modello. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/61529fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61529/61529fig02.jpg"> Figura 2: Ricerca Apex MS. Output della ricerca MS apice per BLOB 5. Elenco delle voci del database con la corrispondenza di somiglianza più elevata e dei metadati correlati disponibili nella raccolta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/61529fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61529/61529fig03.jpg"> Figura 3: Riallineamento dei modelli. Flusso di lavoro che illustra i passaggi che consentono il riabilitamento del modello per trasformazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/61529fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61529/61529fig04.jpg"> Figura 4: Interfaccia gc investigator. Pannello di ricerca con tutte le immagini selezionate etichettate in base alla regione di produzione dell'olio (a sinistra) e l'elenco dei picchi/volumi blob affidabili in ogni campione (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/61529fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61529/61529fig05.jpg"> Figura 5: Modello mirato e UT. (A) Picchi affidabili derivanti dall'elaborazione automatizzata nella fase 11; i cerchi rossi corrispondono agli aaliti noti mentre i cerchi verdi sono sconosciuti. Nel pannello sovrapposto, le proprietà dell'oggetto modello vengono visualizzate per il (Z)-3-hexenal. (B) Area allargata che mostra i picchi UT (cerchi rossi e verdi) e le regioni di picco (grafica rossa) del modello UT abbinati su un olio campione acquisito a 70 energia di ionizzazione eV. (C) Modello UT abbinato ad un olio campione acquisito a 12 eV di ionizzazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/61529fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61529/61529fig06.jpg"> Figura 6: Grafici di carico PCA. Essi mostrano la conformazione naturale dei campioni (oli provenienti dalla Toscana e dalla Sicilia) come risultato della distribuzione mirata dei picchi(A)o della distribuzione dei picchi UT (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/61529fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/Supplemental_Files.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questi file.</a>

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Chromatographic Fingerprinting by Template Matching for Data Collected by Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography

Questo protocollo presenta un approccio alle impronte digitali ed esplora i dati multidimensionali raccolti dalla gascromatografia bidimensionale completa accoppiata alla spettrometria di massa. Algoritmi di riconoscimento dei modelli dedicati (corrispondenza dei modelli) vengono applicati per esplorare le informazioni chimiche crittografate nella frazione volatile dell'olio extravergine di oliva (cioè volatilome).

Fingerprinting cromatografico per corrispondenza dei modelli per i dati raccolti dalla gascromatografia bidimensionale completa

Data processing and evaluation are critical steps of comprehensive two-dimensional gas chromatography (GCxGC), particularly when coupled to mass ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

4.7K Views.  Università degli Studi di Torino. Questo protocollo presenta un approccio alle impronte digitali ed esplora i dati multidimensionali raccolti dalla gascromatografia bidimensionale completa accoppiata alla spettrometria di massa. Algoritmi di riconoscimento dei modelli dedicati (corrispondenza dei modelli) vengono applicati per esplorare le informazioni chimiche crittografate nella frazione volatile dell'olio extravergine di oliva (cioè volatilome).

Video: Chromatographic Fingerprinting by Template Matching for Data Collected by Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography

Quantitative Detection of Trace Explosive Vapors by Programmed Temperature Desorption Gas Chromatography-Electron Capture Detector

The direct liquid deposition of solution standards onto sorbent-filled thermal desorption tubes is used for the quantitative analysis of trace explosive vapor samples. The direct liquid deposition method yields a higher fidelity between the analysis of vapor samples and the analysis of solution standards than using separate injection methods for vapors and solutions, i.e., samples collected on vapor collection tubes and standards prepared in solution vials. Additionally, the method can account for instrumentation losses, which makes it ideal for minimizing variability and quantitative trace chemical detection. Gas chromatography with an electron capture detector is an instrumentation configuration sensitive to nitro-energetics, such as TNT and RDX, due to their relatively high electron affinity. However, vapor quantitation of these compounds is difficult without viable vapor standards. Thus, we eliminate the requirement for vapor standards by combining the sensitivity of the instrumentation with a direct liquid deposition protocol to analyze trace explosive vapor samples.

Trace explosive vapors of TNT and RDX collected on sorbent-filled thermal desorption tubes were analyzed using a programmed temperature desorption system coupled to GC with an electron capture detector. The instrumental analysis is combined with direct liquid deposition method to reduce sample variability and account for instrumentation drift and losses.

Quantitativa Rilevamento di Trace vapori esplosivi di temperatura programmata Desorption Gas Detector cattura cromatografia-Electron

The direct liquid deposition of solution standards onto sorbent-filled thermal desorption tubes is used for the quantitative analysis of trace explosive ...

Ricerca

Chimica

On-line Analysis of Nitrogen Containing Compounds in Complex Hydrocarbon Matrixes

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The composition of heavy crude oils and shale oils varies substantially depending on the origin of the mixture. In particular they contain an increased amount of nitrogen containing compounds compared to the conventionally used sweet crude oils. As nitrogen compounds have an influence on the operation of thermal processes occurring in coker units and steam crackers, and as some species are considered as environmentally hazardous, a detailed analysis of the reactions involving nitrogen containing compounds under pyrolysis conditions provides valuable information. Therefore a novel method has been developed and validated with a feedstock containing a high nitrogen content, i.e., a shale oil. First, the feed was characterized offline by comprehensive two-dimensional gas chromatography (GC &#215; GC) coupled with a nitrogen chemiluminescence detector (NCD). In a second step the on-line analysis method was developed and tested on a steam cracking pilot plant by feeding pyridine dissolved in heptane. The former being a representative compound for one of the most abundant classes of compounds present in shale oil. The composition of the reactor effluent was determined via an in-house developed automated sampling system followed by immediate injection of the sample on a GC &#215; GC coupled with a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS), flame ionization detector (FID) and NCD. A novel method for quantitative analysis of nitrogen containing compounds using NCD and 2-chloropyridine as an internal standard has been developed and demonstrated.

A method combining comprehensive two-dimensional gas chromatography with nitrogen chemiluminescence detection has been developed and applied to on-line analysis of nitrogen containing compounds in a complex hydrocarbon matrix.

Analisi on-line dei composti contenenti azoto in matrici idrocarburi complessi

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. In this method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography mass spectrometry (py-GC-MS) volatile compounds are analyzed during a first desorption run. In the second run, the same dried sample is pyrolyzed for analysis of non-volatile compounds such as pigments and polymers. These can be identified by their specific decomposition patterns. Additionally, this method can be used to differentiate original from counterfeit inks. Easy screening methods for data evaluation using the average mass spectra and self-made pyrolysis libraries are applied to speed up substance identification. Using specialized evaluation software for pyrolysis GS-MS data, a fast and reliable comparison of the full chromatogram can be achieved. Since GC-MS is used as separation technique, the method is limited to volatile substances upon desorption and after pyrolysis of the sample. The method can be applied for quick substance screening in market control surveys since it requires no sample preparation steps.

This method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography with mass spectrometric detection and data evaluation protocol can be used for multi-component analysis of tattoo inks and discrimination of counterfeit products.

Un metodo di cromatografia a gas pirolisi a due fasi con rilevamento spettrometrico di massa per l'identificazione di ingredienti di inchiostro del tatuaggio e prodotti contraffatti

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Caratterizzazione qualitativa della frazione acquosa da idrotermale Liquefazione di alghe Utilizzando 2D gascromatografia con tempo di volo spettrometria di massa

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Bioingegneria

Nitrogen Compound Characterization in Fuels by Multidimensional Gas Chromatography

Certain nitrogen-containing compounds can contribute to fuel instability during storage. Hence, detection and characterization of these compounds is crucial. There are significant challenges to overcome when measuring trace compounds in a complex matrix such as fuels. Background interferences and matrix effects can create limitations to routine analytical instrumentation, such as GC-MS. In order to facilitate specific and quantitative measurements of trace nitrogen compounds in fuels, a nitrogen-specific detector is ideal. In this method, a nitrogen chemiluminescence detector (NCD) is used to detect nitrogen compounds in fuels. NCD utilizes a nitrogen-specific reaction that does not involve the hydrocarbon background. Two-dimensional (GCxGC) gas chromatography is a powerful characterization technique as it provides superior separation capabilities to one-dimensional gas chromatography methods. When GCxGC is paired with a NCD, the problematic nitrogen compounds found in fuels can be extensively characterized without background interference. The method presented in this manuscript details the process for measuring different nitrogen-containing compound classes in fuels with little sample preparation. Overall, this GCxGC-NCD method has been shown to be a valuable tool to enhance the understanding of the chemical composition of nitrogen-containing compounds in fuels and their impact on fuel stability. The % RSD for this method is &#60;5% for intraday and &#60;10% for interday analyses; the LOD is 1.7 ppm and the LOQ is 5.5 ppm.

Here, we present a method utilizing two-dimensional gas chromatography and nitrogen chemiluminescence detection (GCxGC-NCD) to extensively characterize the different classes of nitrogen-containing compounds in diesel and jet fuels.

Caratterizzazione composta azoto nei combustibili mediante cromatografia multidimensionale dei gas

Certain nitrogen-containing compounds can contribute to fuel instability during storage. Hence, detection and characterization of these compounds is ...

Gas Chromatography-Mass Spectrometry Paired with Total Vaporization Solid-Phase Microextraction as a Forensic Tool

Gas Chromatography &#8211; Mass Spectrometry (GC-MS) is a frequently used technique for the analysis of numerous analytes of forensic interest, including controlled substances, ignitable liquids, and explosives. GC-MS can be coupled with Solid-Phase Microextraction (SPME), in which a fiber with a sorptive coating is placed into the headspace above a sample or immersed in a liquid sample. Analytes are sorbed onto the fiber which is then placed inside the heated GC inlet for desorption. Total Vaporization Solid-Phase Microextraction (TV-SPME) utilizes the same technique as immersion SPME but immerses the fiber into a completely vaporized sample extract. This complete vaporization results in a partition between only the vapor phase and the SPME fiber without interference from a liquid phase or any insoluble materials. Depending upon the boiling point of the solvent used, TV-SPME allows for large sample volumes (e.g., up to hundreds of microliters). On-fiber derivatization may also be performed using TV-SPME. TV-SPME has been used to analyze drugs and their metabolites in hair, urine, and saliva. This simple technique has also been applied to street drugs, lipids, fuel samples, post-blast explosive residues, and pollutants in water. This paper highlights the use of TV-SPME to identify illegal adulterants in very small samples (microliter quantities) of alcoholic beverages. Both gamma-hydroxybutyrate (GHB) and gamma-butyrolactone (GBL) were identified at levels that would be found in spiked drinks. Derivatization by a trimethylsilyl agent allowed for conversion of the aqueous matrix and GHB into their TMS derivatives. Overall, TV-SPME is quick, easy, and requires no sample preparation aside from placing the sample into a headspace vial.

Total Vaporization Solid Phase Microextraction (TV-SPME) completely vaporizes a liquid sample whilst analytes are sorbed onto a SPME fiber. This allows for partitioning of the analyte between only the solvent vapor and the SPME fiber coating.

Gas cromatografia-spettrometria di massa abbinata alla microestrazione a fase solida di vaporizzazione totale come strumento forense

Gas Chromatography &#8211; Mass Spectrometry (GC-MS) is a frequently used technique for the analysis of numerous analytes of forensic interest, including ...

Gas Chromatography (GC) with Flame-Ionization Detection

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Gas chromatography (GC) is used to separate and detect small molecular weight compounds in the gas phase. The sample is either a gas or a liquid that is vaporized in the injection port. Typically, the compounds analyzed are less than 1,000 Da, because it is difficult to vaporize larger compounds. GC is popular for environmental monitoring and industrial applications because it is very reliable and can be run nearly continuously. GC is typically used in applications where small, volatile molecules are detected and with non-aqueous solutions. Liquid chromatography is more popular for measurements in aqueous samples and can be used to study larger molecules, because the molecules do not need to vaporize. GC is favored for nonpolar molecules while LC is more common for separating polar analytes.
The mobile phase for gas chromatography is a carrier gas, typically helium because of its&#160;low molecular weight and being chemically inert. Pressure is applied and the mobile phase moves the analyte through the column. The separation is accomplished using a column coated with a stationary phase. Open tubular capillary columns are the most popular columns and have the stationary phase coated on the walls of the capillary. Stationary phases are often derivatives of polydimethylsiloxane, with 5&#8211;10% of the groups functionalized to tune the separation. Typical functional groups are phenyl, cyanopropyl, or trifluoropropyl groups. Capillary columns are usually 5&#8211;50 m&#160;long. Narrower columns have higher resolution but require higher pressures. Packed columns can also be used where the stationary phase is coated onto beads packed in the column. Packed columns are shorter, 1&#8211;5 m. Open tubular capillaries are generally preferred because they allow higher efficiencies, faster analyses, and have higher capacities.
Flame-ionization detection (FID) is a good general detector for organic compounds in GC that detects the amount of carbon in a sample. After the column, samples are burned in a hot, hydrogen-air flame. Carbon ions are produced by the combustion. While the overall efficiency of the process is low (only 1 in 105 carbon ions produce an ion in the flame) the total amount of ions is directly proportional to the amount of carbon in the sample. Electrodes are used to measure the current from the ions. FID is a destructive detector, as the entire sample is pyrolyzed. FID is unaffected by noncombustible gases and water.

Gas Chromatography GC with Flame-Ionization Detection

Gascromatografia con rivelatore a ionizzazione di fiamma

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Gas chromatography (GC) is used to separate and detect small molecular weight compounds ...

Didattica

JoVE Science Education

Chimica analitica

Gas Chromatography: Introduction

Gas chromatography (GC) is a technique for separating and analyzing volatile compounds in a sample. Its primary purpose is to identify and quantify components in complex mixtures, making it essential in fields such as environmental analysis, pharmaceuticals, and petrochemicals. GC is also called vapor-phase chromatography (VPC) or gas-liquid partition chromatography (GLPC).
In GC,&#160; a sample is vaporized and mixed with an inert carrier gas (the mobile phase), which transports it through a column. The column is packed or coated with a stationary phase, either a liquid or solid material. Compounds in the sample are separated based on their boiling points, and compounds with lower boiling points elute first. The elution order- the sequence in which the compound exits the column- is visible on a chromatogram, where each peak corresponds to a specific compound.
There are two main types of gas chromatography:
1. Gas-liquid chromatography (GLC): In GLC, the stationary phase is a nonvolatile, thermally stable, chemically inert liquid, while the mobile phase is a carrier gas, typically helium. This technique is commonly used to separate compounds based on their boiling points.
&#160; 2. Gas-solid chromatography (GSC): GSC uses solid particulates like diatomaceous earth as the stationary phase and a carrier gas like helium as the mobile phase. GSC is primarily used for permanent gases and small polar molecules not retained by gas-liquid columns due to severe tailing of elution peaks.

Gascromatografia: Introduzione

Gas chromatography (GC) is a technique for separating and analyzing volatile compounds in a sample. Its primary purpose is to identify and quantify ...

JoVE Core

Analytical Chemistry

Unit 1

Principles of Chromatography

KEY TERMS AND CONCEPTS

Gas Chromatography&ndash;Mass Spectrometry (GC&ndash;MS)

Gas chromatography&#8211;mass spectrometry (GC&#8211;MS) is the combination of analytical techniques of gas chromatography and mass spectrometry in a single instrument for analyzing a mixture of compounds. The gas chromatograph separates the compounds in the mixture, and the mass spectrometer analyzes each compound separately to determine the molecular masses and molecular structures.
A gas chromatograph consists of a long, narrow capillary column with a polysiloxane coating on the inner wall. The coating material features a high boiling point, low viscosity, and low polarity and functions as the stationary phase of the chromatograph. The analyte is injected into one end of the column and flushed through the column using an inert gas flow as the mobile phase. The boiling point of each compound and its interaction with the stationary phase determines the speed of movement through the column. Consequently, each compound in the mixture reaches the other end of the column at a different time. Eventually, the mass spectrometer connected to the column&#39;s end analyzes each compound separately.

Gas Chromatography&amp;#8211;Mass Spectrometry GC&amp;#8211;MS

Gascromatografia-Spettrometria di massa (GC-MS)

Gas chromatography&#8211;mass spectrometry (GC&#8211;MS) is the combination of analytical techniques of gas chromatography and mass spectrometry in a ...

Fingerprinting cromatografico per corrispondenza dei modelli per i dati raccolti dalla gascromatografia bidimensionale completa

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