Il protocollo qui descritto è stato derivato dall'articolo pubblicato da Jiang et al. (2020). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del MOST (973 Programmi n. 2011CB812502 e 2014CB849902) e dal sostegno finanziario del governo municipale di Pechino.

Tutti i materiali di consumo utilizzati in questo esperimento sono elencati nella tabella dei materiali. Il flusso di lavoro dettagliato del protocollo corrente è illustrato nella Figura 1.
1. Coltura cellulare su dischi di zaffiro
<ol><li>Trasferire dischi di zaffiro da 3 mm x 0,16 mm in una provetta da centrifuga da 2 ml contenente 1 ml di etanolo e sonicare in un pulitore ad ultrasuoni per 10 minuti.</li>
	<li>Bruciare ogni disco di zaffiro in una fiamma di lampada ad alcool fino a quando non ci sono depositi visibili sulla superficie. NOTA: Attraverso il metodo di cui sopra, i dischi di zaffiro possono essere riciclati molte volte.</li>
	<li>Etichettare un lato di ciascun disco di zaffiro con un numero utilizzando una penna resistente ai solventi (Figura 1A). NOTA: La pennarello utilizzata deve essere testata in anticipo per determinare se è resistente ai solventi acetone e metanolo per evitare la perdita di segni.</li>
	<li>Posizionare i dischi di zaffiro etichettati sul fondo di un piatto di coltura da 35 mm con il lato etichettato rivolto verso l'alto.</li>
	<li>Sterilizzare il piatto di coltura cellulare con dischi di zaffiro sotto luce UV per 30 minuti.</li>
	<li>Capovolgere i dischi di zaffiro con una pinzetta (il lato etichettato rivolto verso il basso) e sterilizzare sotto la luce UV per altri 30 minuti. Ora, il piatto di coltura contenente i dischi di zaffiro è pronto per la coltura cellulare. NOTA: I dischi di zaffiro possono anche essere sterilizzati in autoclave.</li>
	<li>Seminare le cellule sui dischi di zaffiro preparati sopra e crescere fino all'80% -90% di confluenza in un incubatore cellulare a 37 ° C, 95% di umidità e 5% di CO2 (Figura 1B). NOTA: Sono state generate linee cellulari HeLa stabili che esprimono tag MTn come descritto in Jiang et al.26.</li>
</ol>2. Congelamento ad alta pressione (HPF)
ATTENZIONE: in questo esperimento viene utilizzato azoto liquido. Quando si lavora con azoto liquido, utilizzare adeguate procedure di sicurezza e dispositivi di protezione individuale per prevenire il congelamento e l'asfissia.
<ol><li>Preparare la macchina di congelamento ad alta pressione almeno 2 ore prima dell'esperimento secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Trasferire i supporti in alluminio HPF di tipo A (incasso: 0,025/0,275 mm) in un tubo di centrifuga da 2 ml contenente 1 ml di etanolo e sonicare in un pulitore ad ultrasuoni per 10 minuti.</li>
	<li>Asciugare i supporti in una capsula di Petri ricoperta di carta da filtro qualitativa (media velocità).</li>
	<li>Immergere i vettori prepuliti in 1-esadecene. NOTA: BSA non è raccomandato come crioprotettore nell'attuale esperimento in quanto interferirà con la successiva sintesi di nanoparticelle d'oro.</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta fine per raccogliere un disco di zaffiro con cellule dal piatto di coltura; Toccare la superficie etichettata con carta da filtro qualitativa (media velocità) per rimuovere il mezzo in eccesso. NOTA: La conduttività termica dell'acqua è molto bassa e troppa acqua residua influirà sull'effetto di congelamento. Trattenere acqua minima per evitare che le cellule si secchino.</li>
	<li>Montare il disco di zaffiro nel supporto del campione HPF e tappare rapidamente il disco con un supporto in alluminio profondo 0,025 mm contenente 1-esadecene (Figura 1C).</li>
	<li>Aspirare la soluzione in eccesso con carta da filtro qualitativa (media velocità).</li>
	<li>Caricare il portacampioni per il congelamento ad alta pressione (Figura 1D). NOTA: Il processo di caricamento del campione deve essere il più veloce possibile (entro 1 minuto) per ridurre al minimo le alterazioni fisiologiche dovute a variazioni di temperatura, umidità, pH e contenuto di ossigeno.</li>
	<li>Scaricare il gruppo portadischi in zaffiro sotto azoto liquido in una crioscatola di schiuma e conservare il gruppo in un crioviale in azoto liquido prima dell'uso. NOTA: il protocollo potrebbe essere messo in pausa qui. I campioni nei crioviali possono essere conservati in un dewar di azoto liquido per anni.</li>
</ol>3. Fissazione del congelamento-sostituzione (FSF) e reidratazione (Figura 1E)
<ol><li>Riempire la macchina automatica di sostituzione del congelamento (AFS) con azoto liquido e raffreddare la camera a -90 °C. ATTENZIONE: in questo esperimento viene utilizzato azoto liquido. Quando si lavora con azoto liquido, utilizzare adeguate procedure di sicurezza e dispositivi di protezione individuale per prevenire il congelamento e l'asfissia.</li>
	<li>Preparare 2 mL di acido tannico allo 0,01% (p/v) in acetone (soluzione FSF 1) in un contenitore rotondo di polipropilene da 20 mm (Figura 1E) in una cappa aspirante e congelarlo in azoto liquido.</li>
	<li>Caricare i campioni (i gruppi portadischi in zaffiro) nel contenitore con la soluzione FSF congelata 1 sotto LN2 usando una coppia di pinzette preraffreddate.</li>
	<li>Trasferire il contenitore nella camera AFS preraffreddata per la lavorazione FSF a -90 °C.</li>
	<li>Conservare i campioni a -90 °C per 1 ora; Quindi, separare i dischi di zaffiro dai supporti con pinzette preraffreddate e assicurarsi che i lati marcati dei dischi di zaffiro siano rivolti verso il basso. NOTA: Le pinzette devono essere sufficientemente preraffreddate per evitare variazioni di temperatura. I dischi di zaffiro dovrebbero essere facilmente separati.</li>
	<li>Conservare a −90 °C per altre 8-10 ore; quindi, riscaldare a -60 °C entro 3 ore.</li>
	<li>Sostituire la soluzione FSF 1 nel contenitore con acetone preraffreddato e incubare per 1 ora. Ripeti questo lavaggio con acetone 2x.</li>
	<li>Caldo a -30 °C entro 3 ore. Durante questo periodo, preparare e preraffreddare 2 mL di acetato di uranile allo 0,01% in acetone (soluzione FSF 2, diluita dal 10% di acetato di uranile in metanolo) in una provetta da centrifuga da 2 ml. ATTENZIONE: L'acetato di uranile, utilizzato nel presente esperimento, è radioattivo e altamente tossico; devono essere manipolati secondo adeguate procedure di sicurezza e smaltiti come rifiuti chimici pericolosi.</li>
	<li>Sostituire l'acetone con la soluzione FSF 2 e incubare a -30 °C per 3 ore.</li>
	<li>Sostituire la soluzione FSF 2 nel contenitore con acetone preraffreddato e incubare per 30 minuti a -30 °C. Ripeti questo lavaggio con acetone 2x.</li>
	<li>Riscaldare da -30 °C a 4 °C entro 2 ore.</li>
	<li>Sostituire l'acetone con 2 mL di tampone HEPES da 0,2 M contenente 1 mM di CaCl 2 e 1 mM MgCl2 a pH 5,5.</li>
	<li>Cambiare il tampone una volta e incubare a temperatura ambiente per 1 ora o a 4 °C durante la notte. NOTA: Il protocollo può essere sospeso qui per una notte o continuato per almeno 6 ore fino a quando i campioni non vengono nuovamente congelati nel passaggio 5.</li>
</ol>4. Sintesi di AuNP basata su ANSM per cellule di mammifero (Figura 1F)
<ol><li>Lavare con tampone PBS-A 3 volte per 5 minuti.</li>
	<li>Trasferire i dischi di zaffiro in un piatto di coltura da 35 mm contenente 1 mL di tampone PBS-A a temperatura ambiente. NOTA: Tenere sempre i lati marcati dei dischi di zaffiro rivolti verso il basso ed evitare di sovrapporre i dischi di zaffiro e di strofinare le celle.</li>
	<li>Preparare la soluzione riducente aggiungendo 4,28 μL di 2-mercaptoetanolo in una provetta da centrifuga da 2 mL contenente 1 mL di tampone PBS-A e mescolando bene in una cappa aspirante. ATTENZIONE: il 2-mercaptoetanolo è tossico e ha un odore pungente; Deve essere maneggiato secondo adeguate procedure di sicurezza.</li>
	<li>Sostituire il tampone PBS-A nel piatto di coltura con 1 mL di soluzione riducente e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare il precursore d'oro prima dell'uso.<ol><li>Aggiungere 80 μL di 10 mM HAuCl4 in ddH 2 O in una provetta da centrifuga da2mL contenente 1 mL di soluzione riducente e immediatamente vortice. Nota : la soluzione potrebbe diventare torbida.</li>
		<li>Aggiungere 80 μL di 500 mM di D-penicillamina in ddH2O nella soluzione di cui sopra e immediatamente vortice. NOTA: la soluzione potrebbe diventare di nuovo chiara.</li>
	</ol></li>
	<li>Sostituire la soluzione nel piatto di coltura con 1 mL di soluzione precursore d'oro preparata al punto 4.5 e incubare per 2 ore a 4 °C. NOTA: Un millilitro del precursore d'oro è sufficiente per reagire con circa 1 × 106 cellule (confluente su un piatto da 35 mm). Sono necessari volumi maggiori del precursore quando le AuNP diventano significativamente più piccole.</li>
	<li>Pesare 0,0038 g di NaBH 4 in una provetta da centrifuga da 1,5 ml, aggiungere 1 mL di ddH2O ghiacciato e vortice per ottenere 100 mM NaBH4 fresco appena prima dell'uso.</li>
	<li>Aggiungere 20-100 μL di 100 mM NaBH 4 alla soluzione dal punto4.6 , agitare immediatamente per mescolare bene e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Preparare 100 mM NaBH4 fresco per l'uso immediato. Dopo aver aggiunto il NaBH4, il colore della soluzione diventerà gradualmente rosso e poi si approfondirà. Se non viene osservato alcun cambiamento di colore, indica in gran parte che l'esperimento è fallito.</li>
	<li>Sostituire la soluzione con 2 mL di tampone PBS-A per interrompere la reazione. NOTA: Interrompere la reazione entro 30 minuti è fondamentale, poiché una reazione prolungata abbatterà gradualmente gli AuNP.</li>
</ol>5. Congelamento ad alta pressione e fissazione di congelamento-sostituzione (figura 1C-F)
NOTA: I campioni sono di nuovo HPF e FSF, e la procedura è quasi la stessa di quella precedentemente descritta nella sezione 2 e nella sezione 3 con alcune modifiche.
<ol><li>Preparare tetrossido di osmio all'1% e acetato di uranile allo 0,1% in acetone (soluzione FSF 3, diluita dal 4% di tetrossido di osmio in acetone e dal 10% di uranile acetato in metanolo). ATTENZIONE: Il tetrossido di osmio e l'acetato di uranile sono sostanze chimiche altamente tossiche; Devono essere manipolati secondo adeguate procedure di sicurezza e smaltiti come rifiuti chimici pericolosi.</li>
	<li>Caricare i campioni (i gruppi portadischi in zaffiro) nel contenitore con la soluzione FSF congelata 3 sotto LN2 usando una coppia di pinzette preraffreddate.</li>
	<li>Trasferire il contenitore nella camera AFS preraffreddata per la lavorazione FSF a -90 °C ed eseguire il programma FSF come segue: mantenere a -90 °C per 8-10 ore; quindi, riscaldare a -60 °C entro 3 ore; mantenere a −60 °C per 3 ore; quindi, riscaldare a -30 °C entro 3 ore; conservare a −30 °C per 3 ore; quindi, riscaldare a 4 °C entro 2 ore.</li>
	<li>Quando la temperatura raggiunge i 4 °C, trasferire le provette nella cappa aspirante e mantenerle a temperatura ambiente per 15 minuti.</li>
	<li>Lavare con acetone 3 volte per 15 minuti ogni volta.</li>
	<li>Conservare in acetone a temperatura ambiente per almeno 2 ore.</li>
</ol>6. Infiltrazione, incorporamento e polimerizzazione della resina
<ol><li>Preparare la miscela di resina epossidica secondo le istruzioni del produttore prima dell'uso. ATTENZIONE: La resina epossidica utilizzata nel presente esperimento è tossica prima della polimerizzazione; Deve essere maneggiato secondo adeguate procedure di sicurezza. La resina non polimerizzata deve essere smaltita come rifiuto chimico pericoloso o polimerizzata prima dello smaltimento.</li>
	<li>Trasferire i dischi di zaffiro in capsule di incorporamento a fondo piatto e infiltrarsi con resina per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Tenere i lati marcati dei dischi di zaffiro rivolti verso il basso.</li>
	<li>Polimerizzare la provetta a 60 °C in forno per almeno 18 ore. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui dopo la polimerizzazione. I blocchi di campioni polimerizzati possono essere conservati in un contenitore asciutto per anni.</li>
</ol>7. Sezionamento ultrasottile
<ol><li>Tagliare accuratamente i blocchi di campioni polimerizzati usando un rasoio per esporre i dischi di zaffiro.</li>
	<li>Immergere le punte dei blocchi con dischi di zaffiro in azoto liquido per alcuni secondi e scongelare a temperatura ambiente. Ripetere più volte l'azione di congelamento-scongelamento per staccare i dischi dai blocchi. NOTA: Evitare il congelamento prolungato, in quanto ciò potrebbe rompere i blocchi del campione. Staccare delicatamente i dischi di zaffiro con una lama, evitando una forza eccessiva, che potrebbe danneggiare i campioni.</li>
	<li>Rifilare la faccia del blocco a una forma trapezoidale per la sezione ultrasottile (Figura 1G).</li>
	<li>Ottenere sezioni ultrasottili a 70-100 nm con un ultramicrotomo (Figura 1H).</li>
	<li>Scegliete le sezioni su griglie esagonali in rame a 200 maglie. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui dopo il sezionamento. Le sezioni sulle cinture possono essere conservate in un contenitore asciutto per anni. Se lo si desidera, le sezioni sulle griglie possono essere colorate con acetone di uranile al 2% per ottenere un migliore contrasto della membrana. La colorazione del piombo dovrebbe essere evitata in quanto maschererà i segnali delle particelle di nanooro.</li>
</ol>8. Imaging TEM (Figura 1I)
<ol><li>Esaminare le sezioni ultrasottili sulle griglie di rame utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione. Tipicamente, un intervallo di ingrandimento da 11 kX a 30 kX è adatto per visualizzare AuNP nelle celle ed è necessario un valore di sfocatura appropriato per garantire che gli AuNP di 2-3 nm siano visibili.</li>
</ol>

Sintesi diretta di nanoparticelle d'oro per l'analisi della localizzazione delle proteine

<ol>
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L'autore non dichiara conflitti di interesse.

Lo studio presenta qui una robusta tecnologia di etichettatura EM clonabile per la visualizzazione di singole molecole di molecole proteiche all'interno dell'ambiente cellulare con risoluzione ultrastrutturale. Le AuNP sintetizzate direttamente su tag ricchi di cisteina geneticamente codificati forniscono una localizzazione univoca e precisa delle proteine bersaglio. La tecnica di congelamento ad alta pressione e di congelamento preserva in modo eccellente l'ultrastruttura dei campioni biologici. Nel complesso, la tecnol...

Nell'era postgenomica, lo sviluppo della proteina fluorescente verde (GFP) come reporter a singola molecola per la microscopia ottica ha rivoluzionato il campo della moderna ricerca sulle scienze della vita 1,2. Per decenni, la microscopia elettronica (EM) è stata un potente strumento per osservare intuitivamente l'ultrastruttura cellulare con risoluzione su scala nanometrica3; Tuttavia, l'identificazione precisa e la localizzazione delle molecole proteiche rimangono impegnative.
La tecnica di marcatura EM più comunemente usata è la tecnica di marcatura al microscopio immunoelettronico (IEM), che si basa sulla reazione antigene-anticorpo. Tuttavia, sebbene siano state sviluppate molte tecniche nel campo dell'etichettatura IEM, tra cui IEM pre-embedding e IEM post-embedding (su sezioni di resina o criosezioni idratate), soffre ancora di bassa efficienza di etichettatura (<10%)4,5, che è correlata alla preparazione del campione e alla qualità degli anticorpi. Per superare queste limitazioni, lo sviluppo di tag geneticamente codificati ha un grande potenziale applicativo.
Due tipi principali di tag EM sono stati accuratamente esplorati negli ultimi anni. Un tipo è il metodo di colorazione DAB, che utilizza tag come APEX2 per ossidare 3,3'-diaminobenzidina (DAB) in polimeri osmiofili per la visualizzazione EM 6,7,8,9,10,11,12. Consente la marcatura di proteine ad alta abbondanza nelle regioni subcellulari, ma non è adatto per il conteggio di singole molecole. L'altro tipo utilizza proteine leganti i metalli, come la ferritina 13 e la metallotioneina (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, per generare depositi metallici densi di elettroni in situ per la visualizzazione EM. Solo quest'ultimo ha un reale potenziale per la visualizzazione e il conteggio di singole molecole. La dimensione molecolare della ferritina è troppo grande (~450 kD) per essere usata come tag promettente, mentre le piccole dimensioni (~5 kD) della MT e la sua capacità di legare vari ioni attraverso le sue 20 cisteine hanno attirato grande attenzione. Diversi laboratori hanno cercato di etichettare le proteine purificate di fusione MT o le cellule che esprimono MT incubando direttamente con Au+. Questi tentativi hanno inizialmente dimostrato che i tag MT possono legare gli ioni d'oro per formare segnali ad alto contrasto, ma nessuno ha realmente raggiunto l'identificazione efficace delle singole proteine nelle cellule, e non sono ampiamente applicabili 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
La tecnica di sintesi AuNP basata su ANSM, che prevede la sintesi di AuNP di dimensioni 2-6 nm direttamente su tag ricchi di cisteina (ad esempio, MT, le varianti MT MTn e MTα, AFP) come etichette ad alta densità di elettroni per la visualizzazione EM, è il primo approccio affidabile e applicabile per l'etichettatura delle proteine e il rilevamento di singole molecole nelle cellule24,25,26. Permette la sintesi specifica di AuNPs su proteine isolate di fusione tag e ha raggiunto un'efficienza di marcatura senza precedenti in cellule procariotiche (E. coli) ed eucariotiche (S. pombe) non fisse o chimicamente fissate. Tuttavia, l'implementazione dello stesso protocollo in sistemi più avanzati come le cellule di mammifero o persino i tessuti comporta ulteriori sfide, come la più complessa omeostasi redox intracellulare e la struttura cellulare più fragile.
Questo studio presenta una tecnologia di etichettatura EM clonabile, che combina la nuova tecnica di sintesi AuNP basata su ANSM per l'etichettatura di tag ricchi di cisteina geneticamente codificati (MT) con il metodo di preparazione del campione HPF / FSF reidratazione HPF / FSF, consente l'identificazione univoca di singole molecole di proteine marcate nella membrana ER, nel lume ER e nella matrice mitocondriale nelle cellule HeLa. Il metodo attuale combina le caratteristiche di un'elevata efficienza di etichettatura, un elevato rapporto segnale-rumore, etichettatura a singola molecola e forte universalità, e questo metodo ha ampie prospettive di applicazione nella ricerca sulle scienze della vita.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier</td>
			<td>Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M HEPES buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL MaxyClear snaplock microtube</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL polypropylene screw cap microtubes</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>81-0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mesh hexagonal copper grid</td>
			<td>Tedpella inc</td>
			<td>G200HEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0482-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company</td>
			<td>31025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated freeze substitution machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td>AFS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF</td>
			<td>Beijing Wulundes Biotech Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-penicillamine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>P0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium</td>
			<td>GBICO</td>
			<td>C11965500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>GBICO</td>
			<td>10099-141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom embedding capsule</td>
			<td>Tedpella inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam cryobox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar 15/95 resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAuCl4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4022-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>sigma&#160;</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPF machine</td>
			<td>Wohlwend&#160;</td>
			<td>HPF compact01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methonal&#160;</td>
			<td>Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company</td>
			<td>12397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>480886-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-A buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper (medium speed)</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>FFT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire discs</td>
			<td>Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent resistant pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62053-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Pon 812 resin</td>
			<td>SPI Inc</td>
			<td>02659-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2 spirit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>GBICO</td>
			<td>C25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramictotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>FC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct synthesis of em-visible gold nanoparticles in cells for protein localization analysis with well-preserved ultrastructure

Analizzare la localizzazione precisa delle molecole proteiche nelle cellule con risoluzione ultrastrutturale è di grande importanza per lo studio di vari processi fisiologici o patologici in tutti gli organismi viventi. Pertanto, lo sviluppo di tag clonabili che possono essere utilizzati come sonde di microscopia elettronica è di grande valore, così come le proteine fluorescenti hanno svolto un ruolo cruciale nel campo dell'imaging ottico. Recentemente è stato scoperto il meccanismo di soppressione dell'autonucleazione (ANSM), che consente la sintesi specifica di nanoparticelle d'oro (AuNP) su tag ricchi di cisteina, come metallotioneina (MT) e proteina antigelo (AFP).
Sulla base dell'ANSM, è stata sviluppata una tecnologia di marcatura al microscopio elettronico, che consente la rilevazione specifica di proteine marcate in cellule procariotiche ed eucariotiche con un'efficienza di marcatura senza precedenti. Questo studio illustra un protocollo per la rilevazione di proteine di fusione MTn (una variante MT ingegnerizzata priva di residui aldeidico-reattivi) in cellule di mammifero con ultrastruttura ben conservata. In questo protocollo, il congelamento ad alta pressione e la fissazione del congelamento-sostituzione sono stati eseguiti utilizzando fissativi non aldeidici (come acido tannico, acetato di uranile) per preservare l'ultrastruttura quasi nativa ed evitare danni all'attività del tag causati dalla reticolazione aldeidica.
Una semplice reidratazione in un solo passaggio è stata utilizzata prima della sintesi AuNP basata su ANSM. I risultati hanno mostrato che le proteine marcate hanno preso di mira vari organelli, tra cui le membrane e il lume del reticolo endoplasmatico (ER), e le matrici mitocondriali sono state rilevate con elevata efficienza e specificità. Questa ricerca fornisce ai biologi un protocollo robusto per affrontare una vasta gamma di questioni biologiche a livello di singola molecola in contesti ultrastrutturali cellulari.

In the postgenomic era, the development of green fluorescent protein (GFP) as a single-molecule reporter for light microscopy has revolutionized the field of modern life science research1,2. For decades, electron microscopy (EM) has been a powerful tool for intuitively observing the cellular ultrastructure with nanoscale resolution3; however, the precise identification and localization of protein molecules remain challenging.
The most commonly used EM labeling technique is the immunoelectron microscopy (IEM) labeling technique, which is based on the antigen-antibody reaction. However, although many techniques have been developed in the field of IEM labeling, including pre-embedding IEM and post-embedding IEM (on resin sections or hydrated cryosections), it still suffers from low labeling efficiency (&#60;10%)4,5, which is related to the sample preparation and antibody quality. To overcome these limitations, developing genetically encoded tags has great application potential.
Two main types of EM tags have been thoroughly explored in recent years. One type is the DAB staining method, which utilizes tags such as APEX2 to oxidize 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) to osmiophilic polymers for EM visualization6,7,8,9,10,11,12. It enables the labeling of high-abundance proteins in subcellular regions but is not suitable for single-molecule counting. The other type utilizes metal-binding proteins, such as ferritin13 and metallothionein (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, to generate electron-dense metal deposits in situ for EM visualization. Only the latter has real potential for single-molecule visualization and counting. The molecular size of ferritin is too large (~450 kD) for it to be used as a promising tag, whereas the small size (~5 kD) of MT and its ability to bind various ions through its 20 cysteines have attracted great attention. Several labs have tried to label purified MT-fusion proteins or MT-expressing cells by incubating directly with Au+. These attempts have initially proved that MT tags can bind gold ions to form high-contrast signals, but none have really achieved the effective identification of individual proteins in cells, and they are not widely applicable14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
The ANSM-based AuNP synthesis technique, which involves synthesizing 2-6 nm-sized AuNPs directly on cysteine-rich tags (e.g., MT, the MT variants MTn and MT&#945;, AFP) as electron-dense labels for EM visualization, is the first reliable and applicable approach for protein labeling and single molecule detection in cells24,25,26. It allows for the specific synthesis of AuNPs on isolated tag fusion proteins and has achieved an unprecedented labeling efficiency in nonfixed or chemically fixed prokaryotic (E. coli) and eukaryotic (S. pombe) cells. However, implementing the same protocol in more advanced systems such as mammalian cells or even tissues involves additional challenges, such as the more complex intracellular redox homeostasis and more fragile cellular structure.
This study presents a clonable EM labeling technology, which combines the novel ANSM-based AuNP synthesis technique for labeling genetically encoded cysteine-rich tags (MT) with the HPF/FSF-rehydration-HPF/FSF sample preparation method, enables the unambiguous single-molecule identification of tagged proteins in the ER membrane, ER lumen, and mitochondrial matrix in HeLa cells. The current method combines the characteristics of high labeling efficiency, a high signal-to-noise ratio, single-molecule labeling, and strong universality, and this method has broad application prospects in life science research.

Autore in primo piano: Sintesi diretta di nanoparticelle d'oro EM-visibili nelle cellule per l'analisi della localizzazione delle proteine con ultrastruttura ben conservata  

Sintesi diretta di nanoparticelle d'oro EM-visibili nelle cellule per l'analisi della localizzazione delle proteine con ultrastruttura ben conservata

Protein detection and localization are essential in biological research. Our protocol describes a novel EM-labeling technology using genetically-encoded tags which allows single-molecule visualization in situ with well-preserved ultrastructure. It is crucial to avoid over-fixation.The labeling method is based on the activity of cysteines in the tags, which are highly sensitive to aldehyde cross-linking. Our protocol avoids use of aldehyde fixatives and preserves the tag activity and ultrastructure. at the same time.EM labeling has always been challenging, suffering from poor morphology or inefficient labeling. Our protocols synthesizes in situ nanoparticles directly on individual proteins to provide clear and precise localization of the target proteins, with a high signal-to-noise ratio, high efficiency, and specificity. We have so far achieved excellent labeling in isolated proteins, E.coli cells, yeast cells, and HeLa cells.We will explore and optimize the method for application to tissue samples. Combining the prevailing cryo-FIB and cryo-EM technologies will allow us to address important biological questions.

La tecnica di sintesi AuNP basata su ANSM è uno strumento estremamente utile per marcare e rilevare proteine marcate con MT con TEM26. Per convalidare la sua robustezza nelle cellule di mammifero, sono state generate tre linee cellulari stabili che esprimono EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn o Mito-acGFP-MTn nelle cellule Hela. KDEL è una sequenza canonica di ritenzione/recupero del reticolo endoplasmatico C-terminale (ER), che mantiene la proteina di fusione EGFP-MTn-KDEL all'interno del lume ER o d...

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Il presente protocollo descrive una tecnologia di marcatura al microscopio elettronico clonabile per rilevare proteine marcate con metallotioneina nelle cellule utilizzando una nuova tecnica di sintesi di nanoparticelle d'oro basata sul meccanismo di soppressione dell'autonucleazione.

Analyzing the precise localization of protein molecules in cells with ultrastructural resolution is of great significance for the study of various ...

Il rilevamento e la localizzazione delle proteine sono essenziali nella ricerca biologica. Il nostro protocollo descrive una nuova tecnologia di etichettatura EM che utilizza tag codificati geneticamente che consente la visualizzazione di singole molecole in situ con un'ultrastruttura ben conservata. È fondamentale evitare un'eccessiva fissazione.Il metodo di etichettatura si basa sull'attività delle cisteine nelle etichette, che sono altamente sensibili alla reticolazione aldeidica. Il nostro protocollo evita l'uso di fissativi aldeidici e preserva l'attività del tag e l'ultrastruttura. allo stesso tempo.L'etichettatura EM è sempre stata impegnativa, soffrendo di scarsa morfologia o etichettatura inefficiente. I nostri protocolli sintetizzano nanoparticelle in situ direttamente sulle singole proteine per fornire una localizzazione chiara e precisa delle proteine bersaglio, con un elevato rapporto segnale-rumore, alta efficienza e specificità. Finora abbiamo ottenuto un'eccellente etichettatura in proteine isolate, cellule E.coli, cellule di lievito e cellule HeLa.Esploreremo e ottimizzeremo il metodo per l'applicazione a campioni di tessuto. La combinazione delle tecnologie crio-FIB e crio-EM prevalenti ci consentirà di affrontare importanti questioni biologiche.

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Research

JoVE Journal

Biology

Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure

817 Views.  National Institute of Biological Sciences, Beijing. Il rilevamento e la localizzazione delle proteine sono essenziali nella ricerca biologica. Il nostro protocollo descrive una nuova tecnologia di etichettatura EM che utilizza tag codificati geneticamente che consente la visualizzazione di singole molecole in situ con un'ultrastruttura ben conservata. È fondamentale evitare un'eccessiva fissazione.Il metodo di etichettatura si basa sull'attività delle cisteine nelle etichette, che sono altamente sensibili alla reticolazione aldeidica....

Video: Autore in primo piano: Sintesi diretta di nanoparticelle d'oro EM-visibili nelle cellule per l'analisi della localizzazione delle proteine con ultrastruttura ben conservata  

Analyzing the precise localization of protein molecules in cells with ultrastructural resolution is of great significance for the study of various physiological or pathological processes in all living organisms. Therefore, the development of clonable tags that can be used as electron microscopy probes is of great value, just as fluorescent proteins have played a crucial role in the field of optical imaging. The autonucleation suppression mechanism (ANSM) was recently uncovered, which allows for the specific synthesis of gold nanoparticles (AuNPs) on cysteine-rich tags, such as metallothionein (MT) and antifreeze protein (AFP).
Based on the ANSM, an electron microscopy labeling technology was developed, which enables the specific detection of tagged proteins in prokaryotic and eukaryotic cells with an unprecedented labeling efficiency. This study illustrates a protocol for the detection of MTn (an engineered MT variant lacking aldehyde-reactive residues) fusion proteins in mammalian cells with well-preserved ultrastructure. In this protocol, high-pressure freezing and freeze-substitution fixation were performed using non-aldehyde fixatives (such as tannic acid, uranyl acetate) to preserve near-native ultrastructure and avoid damage to the tag activity caused by aldehyde crosslinking.
A simple one-step rehydration was used prior to the ANSM-based AuNP synthesis. The results showed that the tagged proteins targeted various organelles, including the membranes and the lumen of the endoplasmic reticulum (ER), and mitochondrial matrices were detected with high efficiency and specificity. This research provides biologists with a robust protocol to address an enormous range of biological questions at the single-molecule level in cellular ultrastructural contexts.

The present protocol describes a clonable electron microscopy labeling technology for detecting metallothionein-tagged proteins in cells using a novel autonucleation suppression mechanism-based gold nanoparticle synthesis technique.

Ricerca

Biologia

﻿Preparing Sapphire Discs for Cell Culture

Preparing Sapphire Discs for Cell Culture  

Transfer three millimeters by 0.16 millimeters sapphire discs to a two-milliliter centrifuge tube containing one milliliter ethanol and sonicate it in an ultrasonic cleaner for 10 minutes. Burn each sapphire disc in an alcohol lamp flame until there are no visible deposits on the surface. Label one side of each sapphire disc with a number using a solvent-resistant pen.Place the labeled sapphire discs on the bottom of a 35-millimeter culture dish with the labeled side facing up. Sterilize the cell culture dish with sapphire discs under ultraviolet light for 30 minutes. Flip the sapphire discs with tweezers, ensuring that the labeled side is facing down, and sterilize under ultraviolet light for an additional 30 minutes.Seed the stable HeLa cell lines expressing MTn tags on the prepared sapphire discs and grow to 80 to 90%confluency in a cell incubator.

Preparazione dei dischi di zaffiro per la coltura cellulare

High-Pressure Freezing (HPF), Freeze-Substitution Fixation (FSF) and Rehydration of Sapphire Disc-Carrier Assembly

Prepare a high pressure freezing or HPF machine, at least two hours before starting the experiment according to the manufacturer's instructions. Transfer Type A HPF aluminum carriers to a two-millimeter centrifuge tube containing one milliliter ethanol and sonicate them in an ultrasonic cleaner for 10 minutes. Dry the carriers in a Petri dish covered with qualitative filter paper.Soak the pre-cleaned carriers in 1-hexadecene. Use fine tweezers to pick up a pre-prepared sapphire disk from the HeLa cell culture dish. Touch the labeled surface with qualitative filter paper to remove the excess medium.Mount the sapphire disk into the HPF specimen holder and quickly cap the disk with a 0.025-millimeters-deep aluminum carrier containing 1-hexadecene. Aspirate excess solution with qualitative filter paper. Load the specimen holder for high-pressure freezing.Unload the sapphire disk carrier assembly under liquid nitrogen in a foam cryo box. Prepare two milliliters of the freeze-substitution fixation or FSF solution one in a 20-millimeter round polypropylene container in a fume hood and freeze it using liquid nitrogen. Use a pair of pre-cooled tweezers to load the sapphire disks and carrier assemblies into the container with frozen FSF solution one under liquid nitrogen.Transfer this container to a pre-cooled automated freeze substitution machine chamber for FSF processing at minus 90 degrees Celsius. Keep the specimens at minus 90 degrees Celsius for one hour, then separate the sapphire disks from the carriers with pre-cooled tweezers, making sure that the marked sides of the sapphire disks are facing down. Keep the specimens at minus 90 degrees Celsius for an additional 8 to 10 hours before warming up to minus 60 degrees Celsius within three hours.Replace the FSF solution one in the container with pre-cooled acetone and incubate at minus 60 degrees Celsius for one hour. Repeat this acetone wash twice. Warm up to minus 30 degrees Celsius within three hours.Meanwhile, prepare and pre-cool two milliliters of FSF solution two in a two-milliliter centrifuge tube at minus 30 degrees Celsius. Replace the acetone with FSF solution two and incubate at minus 30 degrees Celsius for three hours. Then replace FSF solution two in the container with pre-cooled acetone and incubate for 30 minutes at minus 30 degrees Celsius.Repeat this acetone wash twice. Warm for minus 30 to 4 degrees Celsius within two hours. Replace the acetone with two milliliters of 0.2 molar HEPES buffer.Change the buffer once and incubate at room temperature or four degrees Celsius overnight.

Congelamento ad alta pressione (HPF), fissazione a sostituzione di freddo (FSF) e reidratazione del gruppo portadischi in zaffiro

Gold Nanoparticle Synthesis for Mammalian Cells Using Sapphire Discs

Take a pre-prepared HPF and FSF treated sapphire disc containing stable HeLa cells, wash it with PBS-A buffer for five minutes, and repeat this process three times. Transfer the sapphire discs to a 35-millimeter culture dish containing one milliliter of PBS-A buffer at room temperature. Replace the PBS-A buffer in the culture dish with one milliliter of reducing solution and incubate for one hour at room temperature.Prepare the gold precursor in one milliliter of reducing solution and immediately mix by vortexing. Add 80 microliters of 500-millimolar D-Penicillamine in double distilled water to the gold precursor solution. And immediately vortex.Replace the solution in the cultured dish with one milliliter of gold precursor solution and incubate for two hours at four degrees Celsius. Add 20 to 100 microliters of the freshly prepared sodium borohydride solution to the gold precursor solution, immediately shake to mix well, and incubate for five minutes at room temperature. Replace the solution with two milliliters of PBS-A buffer to stop the reaction.Then prepare the epoxy resin mixture according to the manufacturer's instructions, transfer the sapphire discs to flat bottom embedding capsules, and infiltrate with resin for at least 30 minutes at room temperature. Polymerize the specimen at 60 degrees Celsius in an oven for at least 18 hours. Prepare ultra-thin sections of the polymerized specimen by trimming the specimen blocks carefully using a razor to expose the sapphire discs.Dip the block tips with sapphire discs into liquid nitrogen for several seconds and thaw room temperature. Repeat the freeze-thaw action several times to detach the discs from the blocks. The EGFP-MTn-KDEL protein appeared as two to five-nanometer sized gold nanoparticles exclusively distributed in the peripheral ER lumen and in the perinuclear space of the nuclear envelope.The well-preserved ultra structure enabled the single molecule identification of tagged proteins and facilitated the analysis of organelle interactions, such as ER mitochondria interactions. Nanoparticles of the Ost4-EGFP-MTn protein delineated the ER membrane in the outer membrane of the nuclear envelope. Likewise, the Mito-acGFP-MTn expressing cells exhibited specific labeling in the mitochondrial matrix.