MAM, FS e MGM sono finanziati da NIEHS (Progetto 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM e PKS sono supportati dal GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719), finanziato dal CPRIT. L'imaging è anche supportato dall'Integrated Microscopy Core presso il Baylor College of Medicine con finanziamenti da NIH (DK56338 e CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center e John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.

Per garantire risultati ottimali, la parte di laboratorio umida di questo protocollo richiede precauzioni standard prive di RNasi in tutte le fasi. Ad esempio, l'uso di punte di pipette filtrate, recipienti sterili e tamponi privi di RNasi è altamente incoraggiato. Si suggerisce anche l'uso di inibitori della RNasi come i complessi di vanadil ribonucleosidi, specialmente per gli RNA bersaglio a bassa abbondanza.
1. Coltura cellulare e configurazione sperimentale
<ol><li>Mantenere le cellule aderenti del cancro al seno MCF-7 (ATCC #HTB-22) in un pallone di coltura tissutale T75 con fenolo-rosso libero (richiesto solo per esperimenti di stimolazione ormonale) Il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM di L-glutammina, 1 nM piruvato di sodio, 50 U.I./mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina.</li>
	<li>Posizionare i coperchi rotondi rivestiti di poli-D-lisina incisi con acido (da 0,16 a 0,19 mm di spessore, 12 mm di diametro) in una piastra di coltura tissutale multiwell 24. NOTA: Utilizzare 1 M HCl per acidare i coverslip e rivestire con una soluzione da 1 mg/mL di poli-D-lisina ricostituita in PBS sterile (soluzione salina tamponata con fosfato senza Ca++ e Mg++)secondo protocolli standard.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule e lavare una volta con 5 ml di PBS sterile (soluzione salina tamponata con fosfato senza Ca++ e Mg++). Staccare le celle MCF-7 utilizzando 2-3 mL di soluzione di tripsina-EDTA 0,25%. Una volta staccate le cellule, neutralizzare la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% con un volume uguale di mezzi di crescita.</li>
	<li>Trasferire le celle nella sospensione del supporto in un tubo conico da 15 ml, ruotare verso il basso a 391 x g per 1 minuto per pellettare le celle. Rimuovere con attenzione il mezzo dal tubo conico senza disturbare il pellet cellulare e risospenare le cellule in una quantità appropriata di mezzi di trattamento. NOTA: Il mezzo di trattamento è DMEM privo di fenolo-rosso integrato con 5% di FBS distinato e dializzato al carbone, 2 mM di L-glutammina, 1 nM piruvato di sodio, 50 U.I./mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina. Questo mezzo è essenziale per gli esperimenti di stimolazione dell'ormone steroideo in quanto la componente sierica è in gran parte impoverita di steroidi dal carbone che spoglia i mezzi e ha ridotto i fattori di crescita tramite dialisi.</li>
	<li>Semina le cellule su coperture nella piastra multiwell 24 a 60.000-70.000 cellule per pozzo in 500 μL di mezzo di trattamento. Per questo esperimento, la confluenza cellulare dovrebbe essere di circa il 70-80% all'inizio del trattamento. Ottimizza la densità di semina delle cellule in base al tipo di cellula, al tasso di crescita e alla lunghezza dell'esperimento per evitare la confluenza, che complica l'analisi delle immagini. NOTA: per una migliore analisi delle immagini e delle immagini, evitare l'aggregazione delle cellule. A tale scopo, mescolare accuratamente l'aliquota delle cellule pipettando (o brevemente vortice) le cellule un paio di volte prima di erogarle nei pozze. Prima di rimettere le cellule placcate nell'incubatrice, lasciare che le cellule si depositino nella cappa di coltura dei tessuti per circa 20 minuti aiuta a ridurre l'aggregazione cellulare.</li>
	<li>Incubare le cellule per almeno due giorni prima dei trattamenti per garantire la sincronizzazione del ciclo cellulare e la riduzione del background a causa di eventuali molecole di segnalazione che rimangono nel siero spogliato / dializzato dei mezzi di crescita.</li>
	<li>Dopo un'incubazione di 48 ore nei mezzi di trattamento, trattare le cellule MCF-7 con 10 nM 17β-estradiolo (E2) e controllo del veicolo (DMSO), diluite nei mezzi di trattamento per 24 ore. Questo trattamento utilizza una dose saturante di E2 per indurre una risposta massima. Eseguire esperimenti di durata temporale e dose-risposta per determinare empiricamente le condizioni per diversi geni bersaglio, modelli cellulari e tipo di trattamenti. Ad esempio, vedi la nostra recente pubblicazione7.</li>
</ol>2. Preparazione dei buffer
<ol><li>Per preparare il tampone di fissazione, diluire la formaldeide monomerica purificata (venduta dai fornitori di microscopia elettronica come paraformaldeide al 16%) al 4% in PBS sterile Ca++/ Mg++ (soluzione salina tamponata con fosfato più Ca++ e Mg++). Aggiungere vanadyl ribonucleoside complexes (VRC) al tampone di fissazione per una concentrazione finale di 2 mM per ritardare la degradazione dell'RNA.<ol>
<li>Calcolare la quantità totale di tampone di fissazione in base alla richiesta di 300-500 μL di fissativo per pozzettilo di una piastra multiwell 24. Conservare la formaldeide al 4% su ghiaccio fino a quando non è necessario nella fase di fissazione. NOTA: rendere nuovo il buffer di fissazione per ogni esperimento. ATTENZIONE: La formaldeide è un teratogeno che viene assorbito attraverso la pelle. Utilizzare questa sostanza chimica in una cappa aspirante insieme a DPI appropriati in base alle normative istituzionali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per la fase di permeabilizzazione, preparare il 70% di etanolo in acqua priva di nucleasi. Un'opzione alternativa è 0,5% Triton-X100 in PBS sterile Ca++/ Mg++ più 2 mM di VRC. Calcolare la quantità totale di tampone di permeabilizzazione necessaria utilizzando 500 μL di tampone per pozzo.</li>
	<li>Per preparare 9 mL del tampone di ibridazione, aggiungere 2 mL di solfato di destrano al 50% e 1 mL di tampone SSC (citrato di sodio salino) a 6 mL di acqua priva di nucleasi. Vortice per mescolare accuratamente il buffer di ibridazione. Questo buffer può essere conservato a 4 °C per un massimo di una settimana.</li>
	<li>Ci sono cinque fasi di lavaggio separate che richiedono 2x tampone salino di citrato di sodio (SSC). Calcolare il volume finale di 2x buffer SSC necessari anticipando 500 μL di buffer per coverslip per fase di lavaggio. Diluire la quantità richiesta di buffer SSC 20x stock in acqua priva di nucleasi. 2 mM VRC possono essere aggiunti ai passaggi di lavaggio come ulteriore precauzione. Questo buffer può essere conservato a temperatura ambiente per tutta la durata delle fasi di lavorazione.</li>
</ol>3. Fissazione per RNA FISH
<ol><li>Dopo il trattamento, rimuovere il supporto dai fori e lavare una volta con PBS Ca++/Mg++sterile e freddo . Se viene utilizzato un modello di cella a bassa aderenza, non utilizzare un vuoto per aspirare il liquido; utilizzare il pipettaggio manuale per rimuovere con cura i supporti dal lato del pozzo e omettere la fase iniziale di lavaggio. Aggiungere il tampone di fissaggio da 500 μL per 30 minuti sul ghiaccio. NOTA: se il campione è soggetto a degradazione dell'RNA, utilizzare PBS sterile con 2 mM VRC per la fase di lavaggio a questo punto.</li>
	<li>Rimuovere il fissativo e smaltirlo nei rifiuti chimici secondo le normative istituzionali. Lavare le cellule due volte con PBS sterile freddo Ca++/ Mg++ per 3 minuti.</li>
	<li>Rimuovere PBS e aggiungere 500 μL di etanolo al 70% in ciascun pozzo. Sigillare la piastra a 24 pozzetti con un film plastico di paraffina. Posizionare su un rotatore a 4 °C per un minimo di quattro ore. È meglio lasciare i campioni al 70% di etanolo durante la notte. Il protocollo può essere messo in pausa a questo punto e i campioni possono essere conservati per un massimo di una settimana in etanolo al 70%. NOTA: un Triton-X100 allo 0,5% in PBS con soluzione VRC da 2 mM può essere utilizzato come alternativa. Incubare i campioni in 500 μL di questo tampone di permeabilizzazione per 20 minuti a temperatura ambiente su un rotatore. Se si utilizza questo buffer di permeabilizzazione, il protocollo non può essere messo in pausa a questo punto e deve continuare attraverso la fase di ibridazione.</li>
</ol>4. Ibridazione per RNA FISH
<ol><li>Rimuovere il tampone di permeabilizzazione e lavare una volta in 500 μL di 2x tampone SSC più il 10% di formammide per 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore.</li>
	<li>Preparare il buffer di ibridazione completo. Calcolare circa 30 μL di buffer di ibridazione completa per coverslip. Aggiungere formammide al buffer di ibridazione per raggiungere la percentuale necessaria. Ad esempio, se sono necessari 500 μL di tampone di ibridazione completa, allora consisterebbe in 450 μL del tampone di ibridazione precedentemente realizzato più 50 μL di formammide di grado molecolare per raggiungere il 10% vol / vol. Vortice brevemente da mescolare. ATTENZIONE: La formamide è un teratogeno che viene assorbito attraverso la pelle. Utilizzare questa sostanza chimica in una cappa aspirante insieme a DPI appropriati secondo le normative istituzionali.</li>
	<li>Diluire le sonde GREB1 intron (etichettato con Atto 647N) e GREB1 esone (etichettato con Quasar 570) 1:300 nel buffer di ibridazione. Mescolare tramite pipettaggio. Proteggere questo buffer dalla luce e utilizzarlo immediatamente. NOTA: Le sonde sono state progettate e prodotte come dettagliato in Stossi et al7. Le sonde sono solitamente fornite come un pool di sonde oligonucleotidiche essiccate che devono essere ricostituite in tampone TE privo di RNAsi secondo il protocollo del produttore14. La soluzione stock per queste sonde era quindi di 12,5 μM; la concentrazione di lavoro delle sonde è di 42 nM.</li>
	<li>Preparare una camera di umidificazione per la fase di ibridazione notturna. Posare un pezzo di pellicola di plastica di paraffina, non esposta verso l'alto, in una capsula di Vetro di Petri pulita con un decontaminante superficiale per rimuovere le RSI. Saturare due asciugamani di carta con acqua sterile e posizionarli lungo i bordi della capsula di Petri per fornire umidità, poiché l'essiccazione può distruggere l'etichettatura specifica.</li>
	<li>Aliquota delle sonde punteggiando 30 μL di sonde in tampone di ibridazione sul lato pulito del film plastico di paraffina. Distribuire le aliquote delle sonde in modo che le coperture non entrino in contatto tra loro.</li>
	<li>Utilizzando una pinzede sterilizzata, capovolgere delicatamente la cella di coverslips verso il basso sulle sonde nella capsula di Petri di vetro. Evitare bolle d'aria e non applicare pressione sui coperchi. NOTA: non scartare la piastra di coltura tissutale con il buffer SSC 2x, poiché sarà necessario per i passaggi successivi.</li>
	<li>Sigillare la capsula di Vetro di Petri con pellicola di plastica di paraffina e coprire la lastra con un foglio per evitare l'esposizione alla luce ai fluorofori. Incubare durante la notte, fino a 16 ore, a 37 °C su una superficie piana non rotante. Il tempo di incubazione può essere variato empiricamente, tuttavia si raccomanda un minimo di 4 ore. NOTA: i coverslip sono suscettibili di scivolare durante l'incubazione nel buffer di ibridazione, il che può portare a macchie secche sul coverslip e danneggiare il campione.</li>
</ol>5. Preparazione dei campioni per l'imaging 
<ol><li>Il giorno successivo, rimuovere i coperchi dalla camera umidificante usando una pinica e riportarli alla piastra a 24 pozzetti con il lato cellulare verso l'alto. Aggiungere 500 μL di tampone SSC 2x fresco più il 10% di formammide per eliminare la sonda in eccesso e l'ibridazione non specifica. NOTA: Proteggere i campioni dalla luce da questo punto in poi.</li>
	<li>Lavare le celle due volte con 500 μL di 2x tampone SSC più il 10% di formammide per 15 minuti ciascuna a 37°C su un rotatore riscaldato.</li>
	<li>Controbattere il DNA con DAPI a 1 μg/mL in 2x tampone SSC per 10 minuti a temperatura ambiente su un rotatore.</li>
	<li>Lavare una volta con 2x tampone SSC per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Montare i coperchi su vetrini utilizzando supporti di montaggio non indurenti dopo aver rimosso qualsiasi tampone SSC 2x in eccesso con un tovagliolo di carta e un lavaggio rapido in acqua priva di nucleasi per eliminare i sali in eccesso. Infine, sigillare le coperture con uno smalto trasparente.</li>
</ol>6. Microscopia ad alta risoluzione ed elaborazione delle immagini
<ol><li>Immagina i campioni su un microscopio a epifluorescenza ad ampio campo utilizzando un obiettivo a olio 60x o 100x e una fotocamera sCMOS. Vedi la tabella dei materiali per il microscopio specifico e l'obiettivo utilizzato per questo esperimento.<ol>
<li>Imaging completo non appena i campioni vengono completamente elaborati per evitare la degradazione del segnale dipendente dal tempo. NOTA: In questo esperimento viene utilizzato olio ad immersione con un indice di rifrazione (RI) di 1,516. I test empirici dovrebbero essere eseguiti per abbinare il RI dell'olio a campioni specifici, poiché le discrepanze del RI comporteranno aberrazioni della funzione di diffusione del punto che influenzeranno la deconvoluzione dell'immagine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le immagini vengono acquisite con una dimensione dei pixel laterali di 0,10827 μm.</li>
	<li>Ottimizzare la quantità di illuminazione dalla sorgente luminosa (cioè la percentuale di trasmittanza) e i tempi di esposizione per ciascun canale (filtri DAPI, TRITC, CY5 in questo particolare esempio) utilizzando il campione che dovrebbe avere la massima intensità (ad esempio, controlli positivi). In questo esperimento, il campione trattato con E2 dovrebbe avere un'intensità maggiore per entrambi i set di sonde GREB1. Generalmente, la trasmittanza percentuale per le sonde greb1 introne ed esone è del 50-100% e i tempi di esposizione vanno da 0,25 a 0,60 secondi.</li>
	<li>Inoltre, acquisire immagini in condizioni che evitino il fotosableaching e/o qualsiasi saturazione dei pixel della fotocamera. Nella nostra esperienza, ci dovrebbe essere una differenza minima di circa dieci volte tra lo sfondo e l'intensità del segnale. La saturazione di pochi pixel / campo può verificarsi a causa di segnali non specifici nel campione (ad esempio, sporcizia sul coverslip, aggregati di sonda all'esterno della cella), che possono essere accettabili, ma solo se le regioni sature non sono incluse nella quantificazione.</li>
	<li>Per impostare l'acquisizione di uno z-stack, concentrarsi sul campione nel canale DAPI. Selezionare la parte superiore e inferiore dello z-stack alle distanze in cui i nuclei colorati DAPI diventano sfocati. La dimensione del gradino z-stack che abbiamo usato è di 0,25 μm per fetta e lo z-stack totale dovrebbe coprire l'intera cella (circa 10 μm nelle celle MCF-7). Tuttavia, la dimensione del passo z-stack cambierà in base all'obiettivo utilizzato e dovrebbe seguire il criterio di campionamento nyquist. NOTA: Gli introni sono solitamente presenti solo nel nucleo; tuttavia, gli esoni sono sia nel nucleo che nel citoplasma. Pertanto, l'impostazione dello z-stack come descritto sopra catturerà la maggior parte dell'etichettatura dell'introne e dell'esone poiché lo z-stack comprende l'intera cella.</li>
	<li>In genere, l'immagine di un minimo di 200 celle per l'analisi quantitativa in esperimenti preliminari per catturare un'istantanea dell'entità della risposta e della variazione tra le cellule.</li>
	<li>Alcune cellule con immagini sono escluse dall'analisi finale (cioè il tasso di abbandono) perché saranno filtrate dalla pipeline di analisi (cioè cellule che toccano il bordo dell'immagine, cellule apoptotiche / mitotiche). NOTA: quando si selezionano le aree dell'immagine, ci sono alcuni fattori da tenere a mente. Scegli aree con celle uniformemente distribuite e non sovrapposte come definito dalla fluorescenza nucleare etichettata DAPI. Inoltre, prova a selezionare le aree che hanno il minor numero di nuclei lungo i bordi dell'area dell'immagine per evitare di contare le celle parziali. L'imaging automatizzato e imparziale è sempre preferito per gli esperimenti che richiedono analisi statistiche.</li>
	<li>Dopo l'acquisizione, deconvolvere le immagini utilizzando un algoritmo di restauro aggressivo utilizzando 10 cicli (cioè il numero di iterazioni). Genera proiezioni di massima intensità per l'analisi delle immagini (ometti questo passaggio se è richiesta un'analisi 3D specifica). Salvare tutte le immagini di proiezione in base alla profondità di bit della fotocamera utilizzata; nel nostro caso sono state salvate immagini in scala di grigi TIFF a 16 bit. Le immagini RGB hanno una profondità di bit ridotta con conseguente perdita di informazioni; pertanto, le immagini RGB non sono adatte per l'analisi delle immagini.</li>
</ol>7. Analisi delle immagini 
<ol><li>Leggi le istruzioni e scarica il notebook jupyter da github (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).</li>
	<li>Installare la distribuzione Python anaconda (https://www.anaconda.com/distribution/) versione 3.6 o successiva.</li>
	<li>Apri il prompt di anaconda e digita il comando di installazione per installare Simple ITK per anaconda (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).</li>
	<li>Apri il navigatore anaconda e avvia il notebook jupyter. Si aprirà un browser Web che mostra directory e file. Sfoglia le strutture di directory per raggiungere la directory contenente il notebook jupyter scaricato da github.</li>
	<li>Aprire il blocco appunti ed eseguire ogni cella premendo contemporaneamente Maiusc e Invio.</li>
	<li>Seguire i dettagli di ogni funzione e passaggio forniti nel notebook. Per un diverso set di immagini, potrebbe essere necessario modificare alcuni valori dei parametri. NOTA: in breve, i nuclei vengono segmentati dal canale DAPI utilizzando la soglia locale con una dimensione del blocco di 251 pixel, i fori sono stati riempiti e gli oggetti più piccoli di 100 pixel rimossi. I nuclei toccanti sono stati divisi usando un algoritmo spartiacque. La maschera nucleare è stata poi dilatata di 100 pixel e lo spartiacque è stato utilizzato per separare gli oggetti che toccano usando i nuclei come bacini. Per identificare l'RNA allo stato stazionario (esoni), è stata utilizzata la soglia Otsu; per gli alleli attivi trascrizionali (introne), è stata applicata prima una sfocatura gaussiana (sigma = 1) e quindi è stata utilizzata la soglia massima dell'entropia.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Russell, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression:+Transcription.">Gene Expression: Transcription.</a> iGenetics: A Mendelian Approach. , 331-352 (2006).</li><li>Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variety+in+the+level+of+gene+control+in+eukaryotic+cells.">Variety in the level of gene control in eukaryotic cells.</a> Nature. 297, 365-371 (1982).</li><li>K&#246;hler, A., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exporting+RNA+from+the+nucleus+to+the+cytoplasm.">Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).</li><li>Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Technology+and+Biology+of+Single-Cell+RNA+Sequencing.">The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing.</a> Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).</li><li>Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Transcription+Profiling+of+Single+Cells+Reveals+Spatial+Organization+of+Cells+in+the+Mouse+Hippocampus.">In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus.</a> Neuron. 92, 342-357 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursty+Gene+Expression+in+the+Intact+Mammalian+Liver.">Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver.</a> Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-induced+transcription+at+individual+alleles+is+independent+of+receptor+level+and+active+conformation+but+can+be+modulated+by+coactivators+activity.">Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity.</a> Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).</li><li>Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Detection+of+Nuclear+and+Cytoplasmic+RNA+Variants+Utilizing+Stellaris+RNA+Fluorescence+In+situ+Hybridization+in+Adherent+Cells.">Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+detection+of+RNA-DNA+hybrid+molecules+in+cytological+preparations.">Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).</li><li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochrome+labelled+RNA.">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA.</a> Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).</li><li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+biotinated+nucleotide+analog.">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Orjalo, A. V., Johansson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stellaris+RNA+Fluorescence+In+situ+Hybridization+for+the+Simultaneous+Detection+of+Immature+and+Mature+Long+Noncoding+RNAs+in+Adherent+Cells.">Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).</li><li>Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3+Fluorescent+Detection+of+Nuclear+RNA+and+DNA:+Implications+for+Genome+Organization.">Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization.</a> Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+Past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future.</a> Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+A+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+estrogenic+mechanisms+of+bisphenol+A+analogs+through+high+throughput+microscopy-based+contextual+assays.">Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays.</a> Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).</li><li>Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+properties+of+non-estrogenic+substituted+bisphenol+analogs+using+high+throughput+microscopy+and+image+analysis.">Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis.</a> PLoS One. 12, 1-19 (2017).</li><li>Rae, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GREB1+is+a+critical+regulator+of+hormone+dependent+breast+cancer+growth.">GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).</li><li>Heldring, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptors:+How+do+they+signal+and+what+are+their+targets.">Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets.</a> Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).</li><li>Hah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+extensive,+and+transient+transcriptional+response+to+estrogen+signaling+in+breast+cancer+cells.">A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells.</a> Cell. 145, 622-634 (2011).</li><li>Kadam, P., Bhalerao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+size+calculation.">Sample size calculation.</a> International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).</li><li>Kocanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen-responsive+genes+does+not+require+their+nuclear+co-localization.">Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization.</a> PLoS Genetics. 6, (2010).</li><li>Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turbo+FISH:+A+Method+for+Rapid+Single+Molecule+RNA+FISH.">Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+paraformaldehyde-treated+individual+cells+investigated+by+atomic+force+microscopy+and+scanning+ion+conductance+microscopy.">Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy.</a> Nano Convergence. 4, (2017).</li><li>Shieh, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ribonucleoside+vanadyl+complex+(RVC)+for+developing+a+multifunctional+tissue+preservative+solution.">Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution.</a> PLoS One. 13, 1-14 (2018).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).</li><li>Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+dynamic+range+fluorescence+imaging.">High dynamic range fluorescence imaging.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).</li><li>Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+RNA+FISH+for+visualizing+gene+expression+and+nuclear+architecture.">Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture.</a> FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+guidance+for+quantitative+confocal+microscopy.">Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy.</a> Nature Protocols. , (2020).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).</li><li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization:+Quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules.">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules.</a> BMB Reports. 46, 65-72 (2013).</li><li>Sibarita, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+microscopy.">Deconvolution microscopy.</a> Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).</li><li>Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Dynamic+Imaging+of+Genomic+Loci+by+Combined+CRISPR+Imaging+and+DNA+Sequential+FISH.">Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH.</a> Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).</li><li>Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Imaging+with+Multiplexed+Error-Robust+Fluorescence+in+situ+Hybridization+(MERFISH).">RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH).</a> Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).</li><li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Spatial+Genomics+of+the+Nascent+Transcriptome+by+Intron+seqFISH.">Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH.</a> Cell. 174, 363-376 (2018).</li><li>Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+detection+of+RNA+using+MERFISH+and+branched+DNA+amplification.">Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification.</a> Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).</li><li>Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+situ+RNA+profiling+by+sequential+hybridization.">Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization.</a> Nature Methods. 11, 360-361 (2014).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16, 33-41 (2019).</li><li>Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+RNA+ISH,+RNA+FISH+and+protein-RNA+double+labeling+(IF/FISH)+in+Drosophila+ovaries.">Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries.</a> Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).</li><li>Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+mRNA+and+protein+in+single+cells+using+immunofluorescence-combined+single-molecule+RNA+FISH.">Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH.</a> Biotechniques. 59, 209-221 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La metodologia smFISH descritta si basa sui protocolli7,12,14precedentemente pubblicati. In questo protocollo, spieghiamo i passaggi critici che sono stati ottimizzati dal wet-lab (tra cui densità di semina, tempo di fissazione, permeabilizzazione e concentrazione della sonda), all'imaging e all'analisi delle immagini, fornendo una pipeline sperimentale completa per i laboratori interessati a eseguire analisi a singola cellula ...

La trascrizione e la traduzione genica sono i due principali processi coinvolti nel dogma centrale della biologia, che vanno dalla sequenza del DNA all'RNA alla proteina1. In questo studio, ci concentriamo sulla produzione di RNA messaggero (mRNA) durante la trascrizione. La nascente molecola di RNA comprende sia introni non codificanti che esoni codificanti. Gli introni vengono splicati co-trascrizionalmente prima che l'mRNA si muova nel citoplasma per la traduzione sui ribosomi2,3.
Tradizionalmente, la misurazione dell'mRNA viene eseguita in popolazioni di massa di cellule (da centinaia a milioni) con saggi classici come RT-qPCR o Northern blotting. Sebbene molto potenti, questi metodi sono limitati in quanto non forniscono informazioni sulla variazione da cellula a cellula (eterogeneità fenotipica), sull'identificazione del numero di alleli trascrizionalmente attivi e, forse ancora più importante, mancano di informazioni spaziali. Più recentemente, le tecnologie a livello di genoma che consentono il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (RNAseq) hanno iniziato a colmare il divario tra i metodi di imaging e il sequenziamento4. Tuttavia, RNAseq soffre di efficienze di rilevamento relativamente basse e le fasi di elaborazione comportano la completa perdita di informazioni spaziali5. Sebbene l'RNAseq a singola cellula possa fornire informazioni sull'eterogeneità fenotipica tra una popolazione di cellule isogeniche, l'ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA (RNA-FISH) può facilitare un'esplorazione più completa dell'espressione genica bersaglio a livello spaziale e su base allele-per-allele6,7.
RNA FISH è una tecnica che consente il rilevamento e la localizzazione di molecole di RNA bersaglio in cellule fisse. A differenza dei metodi precedenti e laboriosi, l'attuale RNA-FISH all'avanguardia utilizza sonde di acidi nucleici disponibili in commercio che sono complementari alle sequenze di RNA bersaglio e queste sonde si ibridano ai loro bersagli mediante l'accoppiamento di basi Watson-Crick8. Le prime tecniche di ibridazione in situ hanno coinvolto un protocollo simile stabilito da Gall e Pardue nel 1969, poiché un campione è stato elaborato con sonde di acido nucleico che si sono specificamente ibridate a un RNAbersaglio 9. Originariamente il test è stato eseguito utilizzando la rilevazione radioattiva o colorimetrica; tuttavia, nel 1980, lo sviluppo di protocolli di ibridazione fluorescente in situ (FISH) a DNA FISH e successivamente RNA FISH ha aperto la strada verso il rilevamento più sensibile e il potenziale per il multiplexing10,11.
Ulteriori sviluppi nell'RNA FISH hanno portato alla capacità di rilevare e quantificare singole molecole di RNA (smFISH)12,13. Il rilevamento diretto è un metodo in cui le sonde stesse sono etichettate con fluorofori. Una sfida con smFISH è che c'è bisogno di abbastanza sonde / bersaglio ibridanti per facilitare il rilevamento di segnali fluorescenti come punti distinti e limitati dalla diffrazione. Per affrontare questo problema, si può usare un set di sonde di oligonucleotidi di DNA a singolo filamento brevi complementari a varie regioni dell'RNA bersaglio8,12,14. Il legame di più sonde aumenta la densità del fluoroforo locale, rendendo l'RNA visibile come un punto distinto ad alta intensità mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo è vantaggioso perché il legame off-target degli oligonucleotidi nel pool del set di sonde può essere distinto dal vero segnale spot dell'RNA analizzando quantitativamente la dimensione e l'intensità dello spot per distinguere tra segnale reale e legame oligonucleotidico spurio, facilitando così un'analisi più accurata riducendo i falsi positivi12.
Metodi alternativi per rilevare l'mRNA sono il classico metodo di traduzione nick basato su clone BAC e il sistema di DNA ramificato di più recente sviluppo. Nel metodo di traduzione nick clonato con BAC, il DNA da etichettare viene inciso enzimaticamente e un nuovo nucleotide viene aggiunto all'estremità esposta di 3'. L'attività della DNA polimerasi I aggiunge un nucleotide etichettato risultando nella sonda desiderata15,16. La tecnica del DNA ramificato coinvolge sonde oligonucleotidiche che si ibridano in coppie a bersagli di RNA e queste sonde sono amplificate utilizzando più molecole di amplificazione del segnale. Questo metodo può migliorare significativamente il rapporto segnale-rumore, ma l'amplificazione può distorcere la quantificazione accurata poiché i punti fluorescenti possono essere molto diversi per dimensioni e intensità17.
Come sistema modello per questo protocollo, che è pienamente impiegato come parte della partecipazione al NIEHS Superfund Research Program per quantificare gli effetti delle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino a Galveston Bay / Houston Ship Channel, abbiamo utilizzato la linea cellulare positiva al cancro al seno del recettore degli estrogeni (ER) MCF-7 trattata durante la notte con un agonista ER, 17β-estradiolo (E2)7,18,19. E2 regola molti geni bersaglio ER, tra cui il prototipo del gene bersaglio ER, GREB17,20,21,22. Il protocollo smFISH qui descritto utilizza un set di due set di sonde separati spettralmente mirati a GREB1; uno che si ibrida agli esoni e l'altro agli introni, consentendo la misurazione dell'RNA7sia maturo che nascente. Usiamo quindi la microscopia a epifluorescenza accoppiata con la deconvoluzione per l'immagine di campioni etichettati smFISH e quindi applichiamo routine di analisi delle immagini per quantificare il numero di alleli attivi e RNA maturi per cellula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">17&#946; Estradiol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2257</td>
			<td style="width:167px;">CAS Number 50-28-2</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT10017CV</td>
			<td>Manufactured by Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8417</td>
			<td>Without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">3730-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21030CV</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol, 200 Proof (100%)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-678-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353047</td>
			<td>Manufactured by Decon Laboratories</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-753-2978</td>
			<td>Manufactured by Gemini Bio Products</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hyclone Water, Molecular Biology Grade</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH3053802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Immersion Oil 1.516</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29162940</td>
			<td>Manufactured by GE Healthcare Bio-Science</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-glutamine Solution</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT25005Cl</td>
			<td>Manufactured by Corning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MCF-7 cells</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Molecular Grade Formamide</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">PAH5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus 60x/1.42 NA Objective</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:71px;">Bemis Company, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">52858-076</td>
			<td>Distributed by VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicilin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT3001Cl</td>
			<td>Manufactured by Corning</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ribonucleoside Vanadyl Complex</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">101229-716</td>
			<td>Manufactured by New England Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:71px;">Ambion</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium pyruvate, 100 mM</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-360-070</td>
			<td>Manufactured by Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545-81P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X-100, 100 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP151-100</td>
			<td>Manufactured by Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA Solution 0.25%</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9265087</td>
			<td>Manufactured by Vector Laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell analysis of transcriptionally active alleles by single molecule fish

La trascrizione genica è un processo essenziale nella biologia cellulare e consente alle cellule di interpretare e rispondere a segnali interni ed esterni. I metodi tradizionali di popolazione di massa (Northern blot, PCR e RNAseq) che misurano i livelli di mRNA non hanno la capacità di fornire informazioni sulla variazione da cellula a cellula nelle risposte. La visualizzazione e la quantificazione precisa di singole cellule e alleliche è possibile tramite ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH). RNA-FISH viene eseguito ibridando RNA bersaglio con sonde oligonucleotidiche marcate. Questi possono essere ripresi in modalità di throughput medio/alto e, attraverso pipeline di analisi delle immagini, forniscono dati quantitativi su RNA sia maturi che nascenti, il tutto a livello di singola cellula. Le fasi di fissazione, permeabilizzazione, ibridazione e imaging sono state ottimizzate in laboratorio per molti anni utilizzando il sistema modello qui descritto, che si traduce in un'analisi a cella singola di successo e robusta dell'etichettatura smFISH. L'obiettivo principale con la preparazione e l'elaborazione dei campioni è quello di produrre immagini di alta qualità caratterizzate da un elevato rapporto segnale-rumore per ridurre i falsi positivi e fornire dati più accurati. Qui presentiamo un protocollo che descrive la pipeline dalla preparazione del campione all'analisi dei dati in combinazione con suggerimenti e passaggi di ottimizzazione da adattare a campioni specifici.

Per analizzare le risposte ormonali tramite smFISH, ad esempio, abbiamo scelto il modello del recettore degli estrogeni (ER) utilizzato nei saggi ad alto rendimento per determinare la presenza di sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino nei disastri ambientali nel contesto della partecipazione al NIEHS Superfund Research Program7. In questo esperimento, le cellule aderenti del cancro al seno MCF-7 sono state trattate con l'agonista ER 17β-estradiolo (E2, 10 nM) o veicolo (DMSO) per 24 ...

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Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

L'ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH) è un metodo per quantificare con precisione i livelli e la localizzazione di specifici RNA a livello di singola cellula. Qui riportiamo i nostri protocolli di laboratorio convalidati per l'elaborazione a banco umido, l'imaging e l'analisi delle immagini per la quantificazione di RNA a singola cellula di specifici RNA.

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

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JoVE Journal

Biochemistry

3.1K Views.  GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics. L'ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH) è un metodo per quantificare con precisione i livelli e la localizzazione di specifici RNA a livello di singola cellula. Qui riportiamo i nostri protocolli di laboratorio convalidati per l'elaborazione a banco umido, l'imaging e l'analisi delle immagini per la quantificazione di RNA a singola cellula di specifici RNA.

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Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Ricerca

Biochimica

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve intracellular structures and the dynamics of biomolecules with ~20 nm precision. A prerequisite for SMLM are fluorophores that transition from a dark to a fluorescent state in order to avoid spatio-temporal overlap of their point spread functions in each of the thousands of data acquisition frames. BODIPYs are well-established dyes with numerous conjugates used in conventional microscopy. The transient formation of red-shifted BODIPY ground-state dimers (DII) results in bright single molecule emission enabling single molecule localization microscopy (SMLM). Here we present a simple but versatile protocol for SMLM with conventional BODIPY conjugates in living yeast and mammalian cells. This procedure can be used to acquire super-resolution images and to track single BODIPY-DII states to extract spatio-temporal information of BODIPY conjugates. We apply this procedure to resolve lipid droplets (LDs), fatty acids, and lysosomes in living yeast and mammalian cells at the nanoscopic length scale. Furthermore, we demonstrate the multi-color imaging capability with BODIPY dyes when used in conjunction with other fluorescent&#160;probes. Our representative results show the differential spatial distribution and mobility of BODIPY-fatty acids and neutral lipids in yeast under fed and fasted conditions. This optimized protocol for SMLM can be used with hundreds of commercially available BODIPY conjugates and is a useful resource to study biological processes at the nanoscale far beyond the applications of this work.&#160;

Conventional BODIPY conjugates can be used for live-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) through exploitation of their transiently forming, red-shifted ground state dimers. We present an optimized SMLM protocol to track and resolve subcellular neutral lipids and fatty acids in living mammalian and yeast cells at the nanoscopic length scale.

Convenzionale BODIPY Coniugato per la microscopia a super-risoluzione a celle vive e il tracciamento a singola molecola

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

Un saggio di imaging a singola molecola in vitro per l'analisi della cinetica di traduzione dipendente dal cappuccio

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately 20 nm to accommodate large tRNA substrates at the A-, P- and E-sites. Consequently, the ribosome dynamics are naturally de-phased quickly. Single molecule method can detect each ribosome separately and distinguish inhomogeneous populations, which is essential to reveal the complicated mechanisms of multi-component systems. We report the details of a smFRET method based on the Nikon Ti2 inverted microscope to probe the ribosome dynamics between the ribosomal protein L27 and tRNAs. The L27 is labeled at its unique Cys 53 position and reconstituted into a ribosome that is engineered to lack L27. The tRNA is labeled at its elbow region. As the tRNA moves to different locations inside the ribosome during the elongation cycle, such as pre- and post- translocation, the FRET efficiencies and dynamics exhibit differences, which have suggested multiple subpopulations. These subpopulations are not detectable by ensemble methods. The TIRF-based smFRET microscope is built on a manual or motorized inverted microscope, with home-built laser illumination. The ribosome samples are purified by ultracentrifugation, loaded into a home-built multi-channel sample cell and then illuminated via an evanescent laser field. The reflection laser spot can be used to achieve feedback control of perfect focus. The fluorescence signals are separated by a motorized filter-turret and collected by two digital CMOS cameras. The intensities are retrieved via the NIS-Elements software.

Single molecule fluorescence energy transfer is a method that tracks the tRNA dynamics during ribosomal protein synthesis. By tracking individual ribosomes, inhomogeneous populations are identified, which shed light on mechanisms. This method can be used to track biological conformational changes in general to reveal dynamic-function relationships in many other complexed biosystems. Single molecule methods can observe non-rate limiting steps and low-populated key intermediates, which are not accessible by conventional ensemble methods due to the average effect.

Studio di trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola della sintesi proteica del ribosoma

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

Diffusione e assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate di polimeri

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

<meta charset="utf8"></head><body>Ricostituzione nucleosomiale in situ per studi su singole molecole

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Ricostituzione efficiente dei nucleosomi per tecniche a singola molecola

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...