Questo metodo dimostra la calibrazione della quantità di proteine quantificanti nel campione liquido con processo a singola molecola per il conteggio. In particolare, può illustrare come le popolazioni proteiche possono essere etichettate fluorescentmente ad ogni livello di molecola. I metodi precedenti hanno eseguito misurazioni alla rinfusa per analizzare i rapporti molari delle molecole fluorescenti e proteiche, ma non possono rivelare come le popolazioni di proteine eterogenee siano effettivamente etichettate.
I nostri metodi possono farlo direttamente a livello di singola molecola. Il nostro metodo può essere esteso verso test di concentrazione molecolare ultrasensibili e avanzati, che porteranno a futuri metodi diagnostici, consentendo risultati efficienti di molecole patogene nei campioni. Il nostro metodo può essere applicato all'analisi di singole specie proteiche utilizzando anticorpi fluorescenti, nonché all'analisi di più specie utilizzando etichette non specifiche per tutte le proteine separate da elettroforesi o cromatografia.
Il punto più critico della tecnica è ottenere la riproducibilità dei dati. Consiglio di mantenere la stessa condizione sperimentale il più possibile quando si misurano più campioni. La dimostrazione visiva di questa tecnica fornirà come rendere ogni fase sperimentale stabile e riproducibile.
Mostrerà anche alcuni passaggio non comuni nei protocolli biochimici, come lo spin-coating e il lavaggio dei copripiscopio. Per iniziare questa procedura, preparare il buffer di lysing e l'1%Tween-20 come indicato nel protocollo di testo. Utilizzare idrossido di sodio per regolare il pH a 12.
Mescolare 100 microlitri di tampone di lysing con un microliter di un DDT molare e quattro microlitri del 50%CHAPS. Aggiungere un microlitro della coltura cellulare preparata e omogeneizzare la soluzione mediante pipettazione lenta per evitare bolle. Incubare al buio a temperatura ambiente per cinque minuti con delicata agitazione.
Quindi, disomogeneizzare la soluzione coniarla su e giù lentamente. Aggiungere un microgrammo di colorante estere Cy3 NHS e omogeneizzare la soluzione rallentando la pipettazione per evitare bolle. Incubare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti con delicata agitazione.
Ripetere questo processo, aggiungendo la stessa quantità di colorante e incubando il campione una volta. Aggiungere 100 microlitri di idrossido molare HEPES-sodio per regolare il pH della soluzione a 7,2 e per spegnere la reazione. Pipettare lentamente su e giù per omogeneizzare la soluzione.
Successivamente, aggiungere 20 microlitri di Biotina-2-ammina e cinque microlitri di EDC. Omogeneizzare la soluzione tubazione su e giù lentamente. Incubare al buio a temperatura ambiente per un'ora con delicata agitazione.
Successivamente, utilizzare una colonna di ultrafiltrazione con un cutoff di 10 kiloDalton per rimuovere eventuali reagenti di etichettatura non reagenti e concentrare il campione. Dopo aver eseguito SDS-PAGE standard per il campione proteico e una scala molecolare, immagini il gel per identificare la posizione delle bande proteiche. Utilizzare una lama affilata per tagliare le porzioni di gel che includono frazioni proteiche di interesse in base alle posizioni delle bande.
In primo luogo, impostare le copertine che sono 22 millimetri per 22 millimetri e hanno uno spessore di 0,15 millimetri. Utilizzare un detergente al plasma per esporre i coprispavimenti al plasma dell'aria per un minuto per pulire e attivare le loro superfici. Successivamente, utilizzare uno spin coater per ruotare le coverlips con 200 microlitri di tampone di avadina per cinque secondi a 500 RPM, seguito da 30 secondi a 1000 RPM.
Incubare i copricapo a temperatura ambiente per 15 minuti per lasciarli asciugare all'aria. Per preparare le coverlips per il campione proteico, utilizzare un campione proteico che è stato diluito. Posizionare 100 microlitri del campione diluito al centro delle copertine rivestite di avadina.
Incubare al buio a temperatura ambiente per 15 minuti. Per preparare il controllo positivo, posizionare 100 microlitri di biotina fluorescente purificata in cinque idrossido di HEPES-sodio micromolare a pH 7.2 al centro di un coverslip rivestito di avadina. Incubare al buio a temperatura ambiente per 15 minuti.
Per preparare il controllo negativo, spin coat plasma coverslips con 200 microlitri di cinque idrossido HEPES-sodio con due milligrammi per millilitro di BSA senza avadina. Aggiungere 100 microlitri alla biotina fluorescente purificata in cinque idrossido micromolare HEPES-sodio a pH 7.2. Incubare al buio per 15 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, sciacquare ogni coverlip con 200 microlitri di acqua distillata pipettando ai bordi, assicurandosi di non toccare il centro del coperchio con la punta della pipetta. Ripetere questo lavaggio tre volte. Quindi, esporre un numero uguale di nuove copertine al plasma dell'aria per un minuto.
Posizionare un coverslip pulito sopra ogni coverslip rilegato a campione per evitare l'asciugatura. Avviare un microscopio a fluorescenza a campo largo o evanescente. Impostare un coverslip sul microscopio e trovare la messa a fuoco.
Quindi, esegui una scansione dei riquadri per ottenere almeno 100 immagini. In questo studio, l'omogeneità di etichettatura di ogni specie proteica etichettata nelle cellule viene quantificata dopo la separazione con SDS-PAGE. I dati delle immagini grezze per diverse frazioni di peso molecolare delle proteine del lisato cellulare HeLa, così come i controlli positivi e negativi, sono visti qui.
Mentre sia il campione proteico che il controllo positivo mostrano tra 100 e 500 punti per immagine, il controllo negativo mostra pochissimi a nessuno. Ciò dimostra che il processo inibisce sufficientemente il legame non specifico dei coloranti alla superficie del coverslip. Gli istogrammi di intensità spot per i campioni proteici e il controllo positivo presentano picchi multipli, che rappresentano il legame stocastico dei coloranti alle ammine primarie rispettivamente nelle proteine e nelle strutture tetrameriche avadine.
Tutti i punti mostravano lampeggianti e fotobleaching graduale con eccitazione laser continua, evidenziando l'osservazione a livello di singola molecola. L'occupazione dell'etichettatura, o LO, viene quindi calcolata dal rapporto tra il numero di macchie in ogni campione proteico e quello nel controllo positivo. Il LO misurato dal campione di lisato a cellule HeLa varia dal 50% per la frazione di peso molecolare più piccola, al 90% per la frazione a peso molecolare più elevato.
Il LO per l'intero campione di proteoma senza separazione è considerato al 72%È fondamentale utilizzare reagenti appena fatti ed evitare qualsiasi polvere, specialmente durante la preparazione dei copripavimenti. Seguendo questa procedura, l'analisi del conteggio di singole molecole in un determinato volume può essere eseguita per quantificare le concentrazioni di ciascuna proteina. Ad esempio, è possibile eseguire analisi su qualsiasi prodotto grezzo, o prodotti di gel ed elettroforesi capillare.
Questa tecnica apre la strada all'utilizzo dell'imaging a fluorescenza a singola molecola per la medicina molecolare, la chimica organica e l'analisi omica. Colmando il concetto tra concentrazione e numeri. L'idrossido di sodio concentrato è corrosivo e deve essere indossata un'adeguata protezione durante la manipolazione.
Inoltre, la radiazione laser ad alta potenza può causare danni agli occhi, quindi gli occhiali protettivi possono essere indossati.
