Il protocollo offre un metodo semplice per purificare i motori molecolari attivi utilizzando il sistema baculovirus Sf9. Descrive anche la motilità di singole molecole e saggi di scorrimento multi-motore per studiare il meccanismo di regolazione delle proteine motorie. Tutta l'espressione tradizionale del vettore Sf9 di espressione del baculovirus e la purificazione dell'affinità a singolo passo, porteranno la proteina motoria pura e attiva a studiare i dettagli meccanicistici delle chinesine superprocessive in sistemi monomolecolari e multi-motori.
Oltre ai motori Kinesin, il protocollo può essere applicato per studiare le proprietà biochimiche e biofisiche di altre proteine a base citoscheletrica come la dionina e la miosina. Il protocollo è dettagliato e facile da seguire. Alcuni suggerimenti sono di maneggiare attentamente le cellule Sf9 in quanto sono soggette a contaminazione e di seguire le note fornite nel protocollo.
La dimostrazione visiva è altamente efficace, facile da seguire e comprendere i passaggi critici, soprattutto per coloro che non hanno mai eseguito questi test. A dimostrare la procedura saranno Pushpanjali Soppina e Dipeshwari Shewale, dottorandi che lavorano con me e Pradeep Naik. Per iniziare, seminare le cellule in un piatto da 35 millilitri, ad una densità di 4,5 volte 10 alla quinta cella per millilitro.
Dopo 24 ore, mescolare un microgrammo di DNA bacmidico e 100 microlitri di supporti Grace non integrati in un tubo. Mescolare sei microlitri di reagente di trasfezione in un'altra provetta con 100 microlitri di supporto Grace non integrato. Trasferire con attenzione il contenuto del primo tubo nel secondo tubo.
Mescolarli e incubare il composto per 45 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 0,8 millilitri di supporti Grace non integrati alla miscela. Miscelare e aspirare il fluido SFM Sf900 dalle celle.
Aggiungere il mezzo di trasfezione preparato goccia a goccia sulla parte superiore delle cellule e incubare la piastra per sei ore. Quindi rimuovere con attenzione la miscela di trasfezione. Aggiungere due millilitri di materiale SF900 SFM e incubare ulteriormente a 28 gradi Celsius per 48 ore.
Quindi, controllare l'espressione della proteina motoria al microscopio a fluorescenza invertita. Raccogliere il terreno con le cellule infette e girare per cinque minuti, a 500 G.Raccogliere il surnatante e congelare le aliquote. Aggiungere 10 millilitri di materiale SFM SF900 con cellule e un millilitro di materiale virale P-zero, in un matraccio conico sterile da 100 millilitri.
Incubare a 28 gradi Celsius con agitazione costante a 90 giri / min. Dopo 72 ore, ruotare le cellule in un tubo conico sterile da 15 millilitri a 500 G per cinque minuti e raccogliere il surnatante. Per l'espressione proteica su larga scala, infettare 30 millilitri della coltura in sospensione con un millilitro di virus stock P1.
72 ore dopo l'infezione, controllare le cellule per l'espressione proteica e raccogliere le cellule in tubi conici sterili, 50 millilitri. Dopo la centrifuga, scartare il surnatante e raccogliere il pellet cellulare. Per lisare le cellule, aggiungere tre millilitri di tampone di lisi ghiacciato al pellet cellulare.
Ruotare il lisato cellulare a 150.000 G per 30 minuti, a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante e mescolarlo con 40 microlitri di resina di affinità 50% ANTI-FLAG M2. Incubare la miscela a quattro gradi Celsius per tre ore con caduta end-to-end.
Ora pellettare la resina FLAG ruotando a 500 G per un minuto a quattro gradi Celsius. Lavare il pellet di resina FLAG tre volte con tampone di lavaggio ghiacciato. E dopo il terzo lavaggio, drenare accuratamente il tampone di lavaggio.
Quindi, aggiungere 70 microlitri di tampone di lavaggio contenente 100 microgrammi per millilitro di peptide FLAG, al pellet di resina, e incubare per una notte a quattro gradi Celsius, come dimostrato in precedenza. Dopo la centrifuga, raccogliere il surnatante contenente proteine purificate in un tubo fresco. Preparare una miscela di polimerizzazione come descritto nel manoscritto e aggiungere 10 microlitri di tubulina alla miscela di polimerizzazione.
Trasferire il tubo in un blocco termico, preriscaldato a 37 gradi Celsius, e incubare per 30 minuti. Dopo aver preparato il tampone di stabilizzazione dei microtubuli, riscaldarlo e aggiungerlo ai microtubuli polimerizzati. Una volta preparata la camera della cella di flusso della motilità, far scorrere 30 microlitri di soluzione di microtubuli diluiti attraverso la camera.
Dopo 30 minuti, far scorrere da 40 a 50 microlitri di tampone bloccante e incubarlo. Preparare una miscela di motilità e aggiungere un microlitro del motore purificato ad esso. Mescolare bene e far scorrere la soluzione nella camera di motilità.
Sigillare entrambe le estremità della camera di motilità e dell'immagine sotto l'illuminazione TIRF. Concentrati sui singoli motori etichettati mCitirine, che si muovono in modo elaborativo. Mescolare la tubulina marcata con rodamina con tubulina non etichettata in un rapporto di uno a 10.
Dopo 30 minuti di polimerizzazione, aggiungere delicatamente 30 microlitri di tampone di stabilizzazione dei microtubuli preriscaldato e incubare ulteriormente, per cinque minuti, a 37 gradi Celsius. Tagliare i microtubuli mediante pipettaggio con la punta di carico capillare. Dopo aver preparato la camera di flusso della motilità, far scorrere 50 microlitri di nanocorpi GFP purificati Sf9 e incubare per 30 minuti.
Bloccare la superficie di scorrimento del coperchio facendo scorrere 50 microlitri di tampone del blocco. Preparare 50 microlitri della miscela del motore. Farlo scorrere nella camera dopo aver mescolato delicatamente la soluzione e incubare per 30 minuti.
Lavare la camera, due volte, con 50 microlitri di P12-caseina. Preparare la miscela di saggio scorrevole e mescolarla delicatamente, prima di farla scorrere nella camera di motilità. Sigillare le estremità della camera di motilità e visualizzare i microtubuli che scivolano sotto l'illuminazione TIRF.
Dopo 48 ore di trasfezione, le cellule non trasfettate appaiono piccole, rotonde e saldamente attaccate. Tuttavia, le cellule trasfettate che esprimevano proteine, erano vagamente attaccate alla superficie e mostravano un diametro cellulare allargato. Dopo 72 ore, oltre il 90% delle cellule Sf9 esprimeva il motore KIF1A con tag fluorescente, la kinesina-3 e le cellule erano debolmente legate alla superficie.
La proteina motoria kinesina-3 è stata purificata dalle cellule Sf9 trasfettate. Il cimografo raffigura il motore della kinesina-3 che cammina in modo elaborativo, lungo la superficie del microtubulo. Gli eventi di motilità hanno mostrato una velocità media e una lunghezza di corsa di circa 2,44 micrometri al secondo e 10,79 micrometri rispettivamente.
Il cimografo indica lo scorrimento regolare dei microtubuli da parte dei motori della kinesina-3, con una velocità media di circa 1,37 micrometri al secondo. La cosa più importante è aggiungere il tampone di stabilizzazione senza disturbare la miscela di microtubuli e non tagliare il microtubulo. Il protocollo sarebbe utile per altre applicazioni, come misure di ATPasi, analisi biofisiche, meccanismi, saggi di ricostituzione in vitro, eccetera.
Utilizzando motori purificati sf9, abbiamo recentemente dimostrato che i motori kinesin-3 sono veloci e superprocessivi. È interessante notare che questi motori presentano alti tassi di turnover ATP rispetto al motore ben caratterizzato, Kinesin-1.
