Con questo protocollo, possiamo osservare direttamente la scissione del DNA sito-specifica mediante endonucleasi di restrizione a livello di singola molecola. Il nostro approccio multiplex ci consente di misurare il tempo necessario a centinaia di singole REasi per completare il ciclo catalitico. Il multiplexing ci consente di generare distribuzioni ben popolate del tempo di permanenza per la scissione che possiamo adattare alla distribuzione di probabilità gamma per ottenere informazioni sul meccanismo della scissione del DNA.
Iniziare preparando una nuova provetta per ogni oligonucleotide risospeso a 50 microlitri di oligonucleotide e 50 microlitri di soluzione DTT appena preparata in ciascuna provetta, pipettare su e giù per mescolare e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Pipettare delicatamente l'intero volume di ogni miscela di campioni su una colonna preparata e centrifugare a 750 G per due minuti. Dopo la centrifugazione, conservare i campioni che non verranno utilizzati immediatamente a 20 gradi Celsius per prevenire l'ossidazione dei gruppi tiolici e la formazione di legami disolfuro.
Pipettare un'aliquota di 50 microlitri del quantum dot stock in un dispositivo di dialisi per ogni costrutto da realizzare, facendo attenzione a non toccare la membrana con il puntale della pipetta. Dializzare con un volume di tampone CHES pari ad almeno 1.000 volte il volume del campione agitando a 100 giri/min per 15 minuti. Utilizzando un pipettatore, recuperare con cura i punti quantici sospesi dal dispositivo di dialisi e trasferirli in una provetta nuova contenente un volume uguale di soluzione Sulfo-SMCC appena preparata, pipettando su e giù per mescolare.
Incubare per 1 ora a temperatura ambiente agitando a 1.000 giri/min per consentire al Sulfo-SMCC di reagire con le ammine primarie sui punti quantici. Quindi, utilizzare un pipettatore per trasferire con cura ogni campione in un nuovo dispositivo di dialisi. Per rimuovere l'eccesso di Sulfo-SMCC, dializzare con un volume di tampone CHES che sia almeno 1.000 volte il volume contenuto nel dispositivo di dialisi agitando per 15 minuti.
Sostituire il tampone due volte ed eseguire la dialisi con un tampone CHES fresco tre volte in totale, consentendo alla dialisi di procedere per 15 minuti dopo ogni sostituzione del tampone. Quindi ripetere la dialisi con PBS. Utilizzando un pipettatore, recuperare con cura la soluzione contenente i punti quantici dal dispositivo di dialisi e trasferire ogni campione in una nuova provetta contenente una quantità equimolare di oligonucleotide dilatato diluito in PBS.
Incubare per 2 ore a temperatura ambiente agitando a 1.000 giri/min. Aggiungere BSA a ciascun campione per una concentrazione finale di 0,5 milligrammi per millilitro. Quindi utilizzare un pipettatore per trasferire con cura ogni campione in un nuovo dispositivo di dialisi e dializzare contro il tampone di conservazione.
Dopo la dialisi, recuperare con cura ogni campione e inserirlo in una nuova provetta. Conservare i campioni a 4 gradi Celsius. Combinare un campione di oligonucleotidi marcati con punti quantici con un eccesso molare di dieci volte di oligonucleotide biotinilato.
Scaldare il composto in un blocco termico a 75 gradi Celsius e mantenerlo a quella temperatura per 5 minuti. Quindi spegnere il blocco di calore e lasciare raffreddare lentamente il composto. Conservare il costrutto completato a 4 gradi Celsius Utilizzando un multiutensile rotante portatile dotato di una punta a punta di diamante conica, praticare due fori negli angoli opposti della slitta di quarzo per fungere da ingresso e uscita.
Assicurarsi di fissare la slitta in posizione, lubrificare la punta e scorrere costantemente con acqua durante la perforazione. Dopo ogni esperimento, recuperare il vetrino di quarzo preparato immergendo il dispositivo usato nell'acetone per sciogliere l'adesivo e la resina epossidica. Eliminare i componenti rimanenti.
Combina 25 microlitri di soluzione di streptavidina con 80 microlitri di PBS e 20 microlitri di tampone bloccante. Rivestire un vetrino coprioggetti trattato con PEG con questa miscela e incubare in un ambiente umido per 30 minuti. Durante l'incubazione del vetrino coprioggetti, preparare il distanziatore di imaging per creare un canale di flusso.
Tagliare un pezzo quadrato da 1 pollice di materiale distanziatore per immagini, quindi segnare un canale largo 2 millimetri allineato alle estremità dei fori praticati nel vetrino di quarzo. Taglia il canale dal materiale distanziatore con un bisturi. Pulire accuratamente il vetrino di quarzo con acetone per rimuovere eventuali residui di adesivo da esperimenti precedenti.
Staccare un lato del supporto dal distanziatore dell'immagine e posizionarlo con cura sul vetrino al quarzo, facendo attenzione a non coprire i fori di ingresso e uscita. Lavare il vetrino coprioggetto con acqua e asciugarlo con aria compressa. Rimuovere l'altro lato del supporto dal distanziatore di imaging e inserirlo tra il vetrino al quarzo e il vetrino coprioggetti rivestito di streptavidina funzionalizzato utilizzando una pinzetta di plastica per premere insieme il gruppo e rimuovere le bolle d'aria dall'adesivo.
Tagliare l'estremità del tubo ad angolo per garantire il libero flusso della soluzione. Quindi inserire un tubo di polietilene lungo 30 centimetri in ogni foro del vetrino di quarzo. Tenere le provette in posizione con una rastrelliera, quindi utilizzare la resina epossidica per sigillare le provette in posizione e i bordi del dispositivo assemblato.
Una volta che la resina epossidica è stata fissata, inserire l'ago smussato su una siringa vuota nel tubo di uscita del dispositivo e immergere l'estremità del tubo di ingresso in un contenitore riempito con il tampone di bloccaggio. Tirare indietro lo stantuffo della siringa per riempire il dispositivo con il tampone di bloccaggio. Quindi lasciare incubare il dispositivo per almeno 30 minuti prima dell'uso.
Fissare il dispositivo microfluidico alla piastra del tavolino del microscopio con del nastro adesivo. Portare l'obiettivo a contatto con la parte inferiore del dispositivo e posizionare l'obiettivo in modo che il campo visivo si trovi all'interno del canale microfluidico. Dopo aver collegato il tubo di uscita alla pompa a siringa, lavare il canale microfluidico con un nuovo tampone di blocco tirando indietro lo stantuffo della siringa.
Verificare che non vi siano bolle intrappolate nel tubo o nel canale. Diluire 1 microlitro del substrato di DNA preparato in 1 millilitro di tampone bloccante. Posizionare il tubo di ingresso nel substrato di DNA diluito e far fluire 800 microlitri della soluzione di substrato attraverso il canale a una velocità di 200 microlitri al minuto.
Lasciare incubare la soluzione di DNA nel canale per 15 minuti dopo l'arresto del flusso. Dopo l'incubazione, far fluire almeno 800 microlitri di tampone bloccante attraverso il canale a una velocità di 200 microlitri al minuto per risciacquare il DNA non legato fuori dal canale. Regolare la messa a fuoco del microscopio in modo che i punti quantici legati alla superficie siano chiaramente visibili.
Lavare il dispositivo microfluidico con 800 microlitri di tampone sperimentale senza magnesio a una portata di 200 microlitri al minuto. Aggiungere la REasi a un'aliquota di tampone sperimentale senza magnesio e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Flusso 800 microlitri da 400 unità per millilitro di EcoRV attraverso il canale ad una portata di 200 microlitri al minuto.
Inizia l'esperimento facendo scorrere il tampone sperimentale contenente magnesio e fluoresceina a una velocità di flusso di 200 microlitri al minuto. Iniziare a raccogliere i dati immediatamente dopo aver avviato la pompa a siringa. Interrompere l'acquisizione dei dati dopo aver fatto scorrere 800 microlitri di tampone.
Dopo aver introdotto il substrato di DNA nella cella a flusso e aver lavato via il DNA in eccesso e i punti quantici, ci sono in genere migliaia di singoli punti quantici in un campo visivo. Sono fissati stabilmente alla superficie del vetro e non subiscono un oscuramento evidente o uno sbiancamento significativo durante l'esperimento. Quando la REasi ha fluito attraverso il canale in assenza di magnesio, almeno il 95% dei punti quantici presenti all'inizio dell'esperimento può ancora essere visto alla fine del periodo di osservazione.
Tuttavia, quando il tampone contenente magnesio viene fatto scorrere immediatamente dopo la REasi, fino alla metà dei punti quantici scompare entro la fine del periodo di osservazione, in modo simile a quanto si osserva quando REasi e magnesio vengono fatti scorrere insieme attraverso il canale. La scomparsa dei punti quantici avviene rapidamente e si traduce in una forte diminuzione della traiettoria di intensità, fornendo una chiara indicazione del tempo in cui una data molecola di DNA viene scissa. Questo esperimento è stato eseguito con la ben studiata P REase EcoRV di tipo II.
Per estrarre i valori di n e beta dai dati sono stati utilizzati sia l'adattamento non lineare della curva dei minimi quadrati che la stima dei parametri di massima verosimiglianza. I due metodi di stima dei parametri erano in accordo. Utilizzando l'adattamento dei minimi quadrati non lineare, n era 3,52 e beta era 5,78 secondi.
Utilizzando la stima della massima verosimiglianza, n era 3,41 e beta era 6,06 secondi. Questo test può fornire la prova della presenza di passaggi intermedi lungo la via di scissione. L'esecuzione di questo test in condizioni di reazione variabili può aiutare a stabilire la natura degli intermedi di reazione che non possono essere osservati direttamente.
