Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento simultaneo di fibro adipogenici, progenitori e cellule staminali muscolari utilizzando attivatori di fluorescenza di selezione. Le popolazioni pure di queste cellule sono un prerequisito per comprendere il loro ruolo biologico in condizioni fisiologiche e patologiche. Utilizzando questa tecnica, Forbes e le cellule staminali muscolari sono state identificate e isolate dall'ascella o dal muscolo ferito.
L'elevata impunità di Forbes e delle cellule staminali muscolari ci ha permesso di utilizzare queste cellule per diverse tecniche a valle come il trapianto di saccarina e l'analisi del mix mudiale. Per iniziare, posizionare il topo supino eutanasia su un tampone di dissezione e spruzzarlo con etanolo al 70% Per evitare la contaminazione, utilizzare una pinza per pizzicare il centro della pelle della pancia del topo e tagliare orizzontalmente l'apertura di circa un centimetro. Afferrare i bordi della ferita e il disco nel mouse tirando l'apertura nelle direzioni opposte per scoprire i muscoli sottostanti, esporre un lato dell'arto posteriore alla volta.
Prima di raccogliere i muscoli, rimuovere il grasso intermuscolare tra i muscoli posteriori della coscia nell'estremità prossimale del quadricipite per migliorare l'isolamento delle cellule progenitrici fibro adipogeniche e delle cellule staminali muscolari. Successivamente, senza danneggiare il tessuto, utilizzare una pinza affilata per rompere e staccare la fascia per esporre il tibiale inferiore anteriore o TA ed estensore digitorum longus o EDL. Eseguire la punta affilata della pinza sotto i muscoli TA EDL per staccare i muscoli dalla tibia.
Tagliare i tendini, attaccando il TA EDL alla caviglia e tenendolo con una pinza, tagliare i muscoli con le forbici lungo la linea longitudinale del TA EDL. Tagliare i tendini intorno al ginocchio per staccare tutti i muscoli TA EDL. Posizionare i muscoli in un piatto di sei centimetri tenuto sul ghiaccio.
Per isolare i muscoli gastrocnemio tagliare tutti i tendini alla caviglia e staccare i muscoli dalla tibia e dal perone. Tagliare intorno al ginocchio e trasferire i muscoli al piatto. Staccare la fascia intorno al quadricipite e separarla dal femore facendo scorrere la punta affilata della pinza tra il muscolo e l'osso.
Tagliare i tendini intorno al ginocchio e tagliare il resto del muscolo tagliando lungo il femore mentre si tengono i quadricipiti con una pinza all'estremità distale. Posizionare i muscoli nel piatto di sei centimetri. Staccare i muscoli posteriori della coscia e i muscoli rimanenti intorno al femore e trasferirli nel piatto.
Raccogli i muscoli degli arti posteriori in un piatto tenuto sul ghiaccio. Aspirare il mezzo di lavaggio dal piatto e aggiungere uno o due millilitri di tampone di dissociazione muscolare per mantenere i muscoli umidi. Quindi, tritare accuratamente i muscoli Utilizzare un bisturi per strappare e affettare il muscolo e quindi utilizzare le forbici per continuare a tagliare il muscolo in piccoli pezzi per uno o due minuti fino ad ottenere una pasta di liquame di tessuto ben tritato.
Quindi trasferire i muscoli tritati nel tubo conico contenente il tampone di dissociazione muscolare. Sigillare i tubi con pellicola da laboratorio e incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius agitando per un'ora. Dopo un'ora, rimuovere il tubo dallo shaker e riempirlo a 50 millilitri Con il mezzo di lavaggio, capovolgere delicatamente il tubo due volte per garantire la miscelazione.
Centrifugare le celle in un rotore oscillante a 250 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 42 millilitri di surnatante in due nuovi tubi e lasciare otto millilitri nel tubo originale. Riempire i nuovi tubi contenenti 21 millilitri di surnatante fino a 50 millilitri con mezzo di lavaggio.
Quindi centrifugare le cellule a 350 volte G per otto minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare il surnatante e mantenere il pellet sul ghiaccio. Quindi, aggiungere un millilitro di collagenasi, due stock e un millilitro di stock a base dis nel tubo originale contenente otto millilitri di tampone di dissociazione muscolare.
Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri risospendere il pellet 10 volte senza intasarsi. Espellere la soluzione verso la parete del tubo, evitando le bolle di formazione. Sigillare i tubi con pellicola di laboratorio e incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius agitando per 30 minuti.
Dopo 30 minuti, rimuovere il tubo dall'aspirato dello shaker ed espellere la sospensione muscolare 10 volte attraverso una siringa da 10 millilitri con un ago da 20 gauge, riempire ogni tubo fino a 50 millilitri con mezzo di lavaggio e capovolgere il tubo. Quindi centrifugare a 250 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Lasciando otto millilitri nel tubo originale.
Riempire il nuovo tubo fino a 50 millilitri con mezzo di lavaggio, centrifugare nuovamente le celle a 350 volte G per otto minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e mantenere il pellet sul ghiaccio. Posizionare un filtro a celle di nylon da 40 micron nel tubo conico originale da 50 millilitri contenente otto millilitri di mezzo di lavaggio e pre-bagnare il filtro con uno o due millilitri di mezzo di lavaggio.
Mentre si tiene il colino, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per risospendere delicatamente il pellet. Filtrare la sospensione attraverso il filtro cellulare nello stesso tubo per ridurre al minimo la perdita di celle. Filtrare gli altri pellet del tubo nel tubo originale aggiungendo da quattro a cinque millilitri di mezzo di lavaggio a ciascun tubo per risospendere i pellet e trasferire la soluzione all'autofiltro posizionato nel tubo originale.
Dopo aver raccolto tutti i pellet nel tubo originale da 50 millilitri, sciacquare l'autofiltro con altri quattro o cinque millilitri di mezzo di lavaggio. Utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per raccogliere tutto il liquido dalla parte inferiore dell'autofiltrante. Riempire ogni tubo con mezzo di lavaggio fino a 50 millilitri e capovolgere il tubo.
Centrifugare il tubo a 250 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere immediatamente il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet in 600 microlitri di mezzo di lavaggio. Trasferire la sospensione in un micro tubo da centrifuga da due millilitri.
Aggiungere gli anticorpi CD 31 APC CD 45 APC SCA un Pacific Blue VCAM una biotina e alfa sette Integrin PE in un tubo da due millimetri contenente sospensione cellulare. Mescolare delicatamente e incubare le cellule in uno shaker rotante a quattro gradi Celsius per 45 minuti proteggendole dalla luce. Dopo l'incubazione, riempire tutti i tubi fino a due millilitri con mezzo di lavaggio e centrifugare a 250 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 300 microlitri di mezzo di lavaggio. Quindi, aggiungere l'anticorpo streptavidina nei tubi e incubare le cellule in uno shaker rotante a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, riempire i tubi contenenti anticorpi streptavidina a due millilitri con mezzo di lavaggio.
Quindi, centrifugare i tubi e aspirare completamente il surnatante . Dopo il secondo lavaggio, risospendere le cellule nel tubo sperimentale in 500 microlitri di mezzo di lavaggio. Pre-bagnare un tappo filtrante cellulare di un tubo inferiore rotondo in polistirene da cinque millilitri con 200 microlitri di mezzo di lavaggio.
Trasferire la sospensione cellulare dal tubo sperimentale nel tubo inferiore rotondo in polistirene da cinque millilitri e lasciarlo filtrare per gravità. Stampare il tubo da due millilitri contenente la sospensione campione sperimentale con 300 microlitri di mezzo di lavaggio e passarlo attraverso lo stesso tappo filtrante. Utilizzare una pipetta da 200 microlitri per raccogliere tutto il liquido dalla parte inferiore del filtro cellulare.
Sigillare con un cappuccio, lasciare i tubi sul ghiaccio e proteggerli dalla luce. La strategia di gating adottata per l'isolamento del progenitore fibro adipogeno e delle cellule staminali muscolari è mostrata qui. Il PD GFR alpha E G F P knock in topi reporter esprime il gene di fusione H due B E G F P P dal locus alfa endogeno PD G FFR, consentendo una marcatura efficiente e specifica della linea alfa PD G GFR.
La purezza delle popolazioni cellulari isolate è stata confermata dalla colorazione immuno di cellule staminali fibro adipogeniche positive alla co-coltura GFP e cellule staminali muscolari con anticorpi PAC-sette. Il progenitore fibro adipogeno GFP positivo non ha espresso il marcatore PAC-sette, mentre le cellule staminali muscolari hanno reagito con questo anticorpo. Tutte le cellule che esprimono GFP erano positive per SCA uno e negative per CD 31, CD 45 VCAM one e alfa sette integrina.
Vengono mostrati il progenitore fibro adipogenico e le cellule staminali muscolari isolate da topi feriti con iniezioni intramuscolari di nessuna tossina sette giorni dopo l'infortunio. Man mano che le cellule staminali muscolari vengono attivate, aumenta le dimensioni cellulari. È importante regolare i parametri F SCA e SS CA ed espandere il gate per includere tali celle al centro.
La quantificazione del progenitore fibro adipogenico e delle cellule staminali muscolari nei muscoli TA illesi e sette giorni dopo l'infortunio sono mostrati qui. Sebbene il picco e la proliferazione siano stati osservati tra i due e i tre giorni, un basso tasso di cellule proliferanti era ancora apprezzabile sette giorni dopo l'infortunio. L'esecuzione di una corretta macinazione muscolare è di fondamentale importanza per rilasciare una singola cellula.
Inoltre, l'isolamento delle cellule mononucleotidiche si ottiene facendo passare la sospensione su una siringa da 10 millilitri con un ago da 20 gauge. Questa tecnica aiuterà gli scienziati a studiare il profilo trascrizionale ed epigenomico biologico di Forbes e delle cellule staminali muscolari in condizioni normali e durante le fasi più profonde della rigenerazione muscolare.
