Il normale apporto di sangue alla coclea è di fondamentale importanza per la malattia di Meniere della coclea, in particolare per il mantenimento del potenziale cocleare interno, che è la forza trainante essenziale per la transazione delle cellule ciliate. Questa funzione della circolazione sanguigna è stata strettamente associata a diverse forme di perdita dell'udito. Una migliore comprensione del flusso sanguigno cocleare consentirà una gestione più efficace dei disturbi dell'udito derivanti dalla disfunzione del flusso sanguigno.
Tuttavia, la misurazione diretta del flusso sanguigno è molto impegnativa a causa della difficoltà di valutare l'orecchio interno. Le tecniche per valutare il flusso sanguigno cocleare sono attualmente ancora in fase di sviluppo. Qui dimostriamo uno dei recenti metodi stabiliti nel nostro laboratorio aprire la finestra muscolare in alloggi con microscopio a fluorescenza ad alta risoluzione per restringere il flusso sanguigno cocleare in piccole specie animali come il topo.
L'applicazione di questa tecnica con modelli di massa transgenici ha il potenziale per far progredire la ricerca per svelare i legami tra la funzione uditiva e la patologia correlata al flusso sanguigno cocleare nel rischio intravascolare. Le nostre procedure devono essere condotte con cautela. Oltre all'emorragia momentanea del corpo, i segni vitali dell'animale, tra cui la pressione sanguigna e il battito cardiaco, devono essere monitorati durante l'intervento chirurgico.
Inizia raccogliendo circa un millimetro di sangue nell'eparina mediante puntura cardiaca. Centrifugare il sangue a 3000 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il plasma, quindi lavare il pellet delle cellule del sangue con un millilitro di PBS tre volte mediante centrifugazione a 3000 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius.
Etichettare le cellule del sangue con un millilitro di 20 micromolari DiO o Dil in PBS e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule del sangue marcate con un millilitro di PBS e centrifugare tre volte a 3000 volte G per tre minuti. Risospendere il pellet cellulare in ematocrito al 30% con circa 0,9 millilitri di PBS prima dell'iniezione.
Preparare strumenti chirurgici sterili e piattaforma di imaging e posizionare una piastra riscaldante sotto il drappo. Monitorare il cattivo riflesso e il tono muscolare generale dei topi anestetizzati per verificare la profondità dell'anestesia. Posizionare l'animale sulla piastra riscaldante calda e la sua coda nel sistema di monitoraggio per il monitoraggio della pressione sanguigna e del battito cardiaco.
Mantenere la temperatura rettale a 37 gradi Celsius e registrare la pressione sanguigna sistolica dell'animale, la pressione sanguigna diastolica e la pressione sanguigna media nella condizione anestetizzata. Aprire la bolla timpanica sinistra tramite un approccio laterale e vennale al microscopio stereo lasciando intatta la membrana timpanica e gli ossicini. Fai un'incisione lungo la linea mediana del collo dell'animale con la testa immobilizzata per ridurre al minimo il movimento.
Rimuovere la ghiandola sottomandibolare sinistra e la pancia posteriore del muscolo digastrico e cauterizzare. Localizzare ed esporre la bulla ossea identificando il muscolo sternocleidomastoideo e il nervo facciale che si estende anteriormente verso la bolla. Aprire la bolla ossea con un ago calibro 30 e rimuovere con attenzione l'osso circostante con una pinzetta chirurgica per fornire una visione chiara dell'arteria cocleare e stapediale con il suo margine mediale che giace oltre il bordo della nicchia rotonda della finestra e causa superiore anteriore verso la finestra ovale.
Utilizzare una piccola lama di coltello per raschiare l'osso della parete laterale all'apice della coclea del topo a circa 1,25 millimetri dall'apice fino a quando un punto sottile non si incrina. Rimuovere i trucioli ossei con piccoli ganci metallici. Coprire il finestrino della nave con una linguetta di copertura tagliata per preservare le normali condizioni fisiologiche e fornire una vista ottica per la registrazione delle immagini della nave.
Fare un'incisione di un centimetro lungo la vena safena destra per esporre il vaso. Infondere successivamente 100 microlitri ciascuno della soluzione FITC-Dextran e la sospensione di cellule del sangue nell'animale attraverso la vena safena per consentire la visualizzazione dei vasi sanguigni e il monitoraggio del flusso sanguigno. Osservare il flusso sanguigno in tempo reale su un monitor video cinque minuti dopo l'iniezione.
Immagini dei vasi sanguigni utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo a lunga distanza di lavoro e un alloggiamento della lampada contenente un filtro di eccitazione a banda multipla e un filtro di emissione compatibile. Registra il video utilizzando una fotocamera digitale in bianco e nero ad alta risoluzione che acquisisce più di 350 immagini per video. Per garantire un'analisi corretta della velocità del flusso.
Misurare il diametro del recipiente utilizzando un software appropriato e determinare la distanza tra due punti fissi attraverso il recipiente nelle immagini acquisite. Apri il video del flusso sanguigno nel software e imposta la scala delle immagini. Tenere traccia delle cellule del sangue colorate con DiO selezionate utilizzando la funzione di tracciamento.
Quindi utilizzare la distanza spostata dalle celle e l'intervallo di tempo tra i fotogrammi dell'immagine nel video per il calcolo automatico della velocità del flusso. Calcolare la portata volumetrica utilizzando l'equazione fornita nel manoscritto testuale. Per creare il modello di esposizione al rumore prima della registrazione del flusso sanguigno, posizionare gli animali in gabbie di rete metallica ed esporli al rumore a banda larga a 120 decibel di pressione sonora in una cabina di esposizione sonora per tre ore.
Poi per altre tre ore il giorno successivo. Registra il flusso sanguigno due settimane dopo l'esposizione al rumore. Dopo l'esposizione chirurgica dei capillari cocleari nella parete laterale, l'osservazione microscopica a fluorescenza ad alta risoluzione intravitale delle cellule del sangue marcate con DiL nei vasi marcati con destrano FITC è stata eseguita attraverso una finestra vasale aperta.
Le cellule del sangue marcate con DiL nei vasi Stria marcati con FITC Dextran sono mostrate qui. Le cellule del sangue marcate con Dio marcate con FITC Dextran mostrano che la densità vascolare del legamento a spirale è più rada di quella della più densa Stria vascularis. IVM ad alta risoluzione mostra i modelli di flusso sanguigno nei gruppi di controllo e esposti al rumore.
Il modello disturbato della circolazione sanguigna può essere visto nei gruppi esposti al rumore. Le anomalie includevano la riduzione del diametro del vaso e l'aumento della variazione del diametro del vaso. Le velocità del flusso sanguigno nei gruppi di controllo e esposti al rumore sono state calcolate monitorando le radici delle cellule del sangue marcate con DiO.
La velocità e il volume del sangue nel gruppo esposto al rumore erano significativamente inferiori rispetto al gruppo di controllo. La creazione di successo della finestra aperta della nave richiede un alto grado di abilità chirurgica. Bisogna fare attenzione nella rimozione dell'osso della parete laterale cocleare.
