Il presente protocollo descrive una misura di rilevamento della permeabilità paracellulare in vivo per valutare la funzione delle giunzioni endoteliali strette nelle ghiandole sottomandibolari di topo. La microscopia a scansione laser a due fotoni, tuttavia, non solo ha il vantaggio della microscopia confocale convenzionale, ma può anche essere utilizzata per rilevare più chiaramente tessuti e immagini più profondi. Questo esperimento fornisce un buon metodo di misura per valutare la permeabilità vascolare di diversi tessuti, in particolare i tessuti superficiali e gli organi degli animali.
Inizia scegliendo traccianti appropriati come fluoresceina, isotiocianato, destrano marcato e Rhodamine B, destrano marcato con spettri di emissione di eccitazione distinti, per ridurre al minimo l'interferenza tra i segnali di fluorescenza per il saggio di permeabilità. Diluire le tracce in soluzione salina tamponata con fosfato sterile in 100 milligrammi per millilitro di scorte e conservare le aliquote al riparo dalla luce a meno 20 gradi Celsius. Dopo aver anestetizzato il topo selvatico maschio di 8-10 settimane, tenere delicatamente la testa e il collo del topo per far sporgere leggermente un lato del bulbo oculare.
Inserire una siringa da insulina contenente 100 microlitri di miscela di soluzione tracciante fluorescente lungo l'angolo dell'occhio ad angolo retto rispetto all'occhio. Dopo l'iniezione, posizionare rapidamente il mouse sul cartone in posizione supina con gli arti e la testa nastrati. Per l'isolamento della ghiandola sottomandibolare o SMG, al microscopio stereoscopico, tagliare l'epidermide del collo con forbici tissutali generali per esporre entrambi i lati delle SMG.
Quindi, utilizzare un ago per la separazione del tessuto smussato per separare delicatamente la capsula dalla superficie della ghiandola senza danneggiare il tessuto ghiandolare, i vasi sanguigni e la struttura ghiandolare. Collegare il supporto personalizzato al dispositivo a pressione negativa e verificare in anticipo se l'effetto della pressione negativa è stato raggiunto correttamente. Posizionare delicatamente l'SMG esposto sul supporto personalizzato e aspirare il tessuto mediante aspirazione a pressione negativa, il più lontano possibile dal corpo del topo, per ridurre gli artefatti di movimento causati dalla respirazione e da altre condizioni.
Iniziare l'imaging subito dopo aver scelto il sito della ghiandola. Acquisire immagini sequenziali lungo l'asse Z a due micron di distanza dalla superficie della ghiandola fino a 70-140 micron nel tessuto per generare una costruzione tridimensionale. Successivamente, acquisire l'imaging time-lapse dei vasi per misurare la permeabilità vascolare nella SMG.
Nella finestra di dialogo Explorer, fare clic su Aggiungi nuova cartella" e modificare il nome del file. Quindi, torna alla colonna di acquisizione. In XY, il formato è 512 per 512 e la velocità è 400 hertz.
Attivare "X" bidirezionale, impostare il fattore di zoom su 0,75 e 1,5 per lo zoom. Quindi, selezionare XYT in Modalità di acquisizione "per acquisire l'imaging time lapse. Impostare la durata su 20 secondi, 30 minuti o più a seconda delle esigenze sperimentali.
Dopo aver impostato le condizioni, fare clic su "Live" per osservare l'imaging vascolare di due canali e canali sovrapposti nella cornice di formazione della foto e scegliere le aree di interesse. Fare clic su Start" per iniziare l'imaging. Saggio di permeabilità vascolare in vivo e immagini tridimensionali dei vasi sanguigni nei topi.
Le ghiandole sottomandibolari sono mostrate qui. Nel gruppo di controllo, entrambi i traccianti esistevano nei vasi sanguigni dell'SMG. A causa del suo piccolo peso molecolare, FD4 è stato in grado di fuoriuscire dai vasi sanguigni ai lati basali di acini e condotti, raffigurando così chiaramente la forma degli acini e dei condotti.
L'RD70 è stato distribuito in vasi sanguigni e microvasi di grandi dimensioni. Nel gruppo di legatura del dotto, sia FD4 che RD70 sono stati stravasati ai lati basali degli acini, il che ha indicato che la legatura del dotto potrebbe interrompere la funzione di barriera endoteliale e aumentare la permeabilità alle grandi molecole. Inoltre, i risultati semi-quantitativi dell'intensità di fluorescenza FD4 e RD70 hanno confermato queste osservazioni.
Le immagini tridimensionali hanno mostrato una fluorescenza molto più oscurata di FD4 e RD70 intorno ai vasi sanguigni nel gruppo di legatura rispetto al gruppo di controllo. Un attento isolamento SMG e un posizionamento appropriato e il microscopio sono prerequisiti essenziali per una rilevazione di successo. Seguendo le procedure, la portata sanguigna può essere calcolata sposando il movimento dei globuli rossi e l'infiltrazione delle cellule del sangue marcate con fluorescenza può essere inseguita.
