Lo studio di regioni cerebrali distinte è un trampolino di lancio verso la comprensione della complessità molecolare e strutturale del cervello. Questo protocollo descrive una dissezione sistematica del cervello del topo per isolare regioni cerebrali distinte. Nella prospettiva dell'anatomia del cervello, è un approccio top-down che può essere facilmente riprodotto.
I vantaggi di questo protocollo sono duplici. In primo luogo, questo approccio offre l'opportunità di comprendere le basi molecolari di regioni cerebrali piccole ma critiche. In secondo luogo, l'intero processo di dissezione è sufficientemente breve da garantire la conservazione dell'integrità molecolare, un prerequisito fondamentale per i test dorsali e molecolari.
Questa procedura comporta pratica e manipolazione delicata. La tempistica è molto cruciale qui per mantenere i punti di riferimento strutturali e può essere raggiunta con una formazione e una pratica adeguate. A dimostrare la procedura di rimozione del cervello del topo sarà Seid Muhie, un chimico ricercatore e bioinformatico del nostro laboratorio.
A dimostrare ulteriormente la procedura di dissezione del cervello del topo sarà James Meyerhoff, un neuroscienziato del nostro laboratorio. Per iniziare, pulire e rimuovere la pelle per una buona presa. Bloccare la mascella della testa decapitata con un emostato e utilizzare una garza per riflettere il cuoio capelluto rostralmente.
Inserire le sottili forbici curve nel forame magno per separare le meningi aderenti. Quindi inserire le forbici all'apertura della base del cranio dove passa il midollo spinale con la lama rivolta verticalmente, ma parallela e premendo contro la superficie interna dell'osso della piastra basale, ruotando la lama di 45 gradi sul lato sinistro e poi sul lato destro. Rimuovere l'osso occipitale nell'osso intraparietale per esporre il cervelletto.
Far avanzare le forbici rostralmente lungo la sutura sagittale media fino al bregma, e tagliarla sollevandola verso l'alto per evitare la lacerazione delle cortecce cerebrali. Mentre le ossa parietali vengono sollevate, identificare e tagliare gli attaccamenti meningei rimanenti. Fai due tagli paralleli nel piano sagittale e rimuovi i frammenti dell'osso frontale, evitando di lacerare la superficie del cervello.
Mentre si tagliano gli attacchi meningei e i nervi cranici, invertire il cranio per consentire alla gravità di aiutare nella rimozione del cervello in una piccola tazza pre-riempita con soluzione salina. Mantenere intatta la bulla uditiva affinché l'anatomia ipofisaria sia identificabile. Fai un taglio parasamentotale estremamente piccolo su entrambi i lati nella cresta della tenda membrosa che tiene l'ipofisi al suo posto e solleva il lobo posteriore dell'ipofisi con una pinza ultra fine.
Fai un taglio sagittale tra i margini laterali del lobo anteriore dell'ipofisi nel nervo trigemino più vicino, quindi solleva il lobo anteriore dell'ipofisi. Dirigere la fonte di luce bianca sul tessuto. Posizionare il cervello su un blocco di acciaio inossidabile pre-raffreddato e mantenere il blocco freddo circondandolo con ghiaccio in una soluzione salina ghiacciata.
Inumidire periodicamente il tessuto con soluzione salina ghiacciata per preservare le strutture. Posiziona il cervello in modo tale che le cortecce cerebrali siano rivolte verso l'alto. Usando una piccola pinza curva, rimuovere il cervelletto.
Usando l'approccio dorsale, far scivolare le lame chiuse di una piccola pinza curva sotto il corpo calloso e allargarla delicatamente per ritrarre la neocorteccia bilateralmente per preservare i punti di riferimento della linea mediana criticamente salienti. Eventuale lato verso l'alto, sarebbero visibili strutture come chiasma ottico, ipotalamo, bulbi olfattivi, midollo allungato, ceppo ipofisario e ponte pontino. Prova a separare gli emisferi.
Capovolgere il sito ventrale del cervello verso l'alto e fare un taglio sagittale medio a partire dal dorso tra i bulbi olfattivi negli emisferi cerebrali. Rimuovere il midollo e quindi separare delicatamente i due emisferi. Quindi, effettuare un taglio coronale sul margine interno degli stagni per ottenere il cervello posteriore e separare il midollo sul margine posteriore degli stagni.
Capovolgere il tessuto cerebrale per un'attenta separazione dei due emisferi cerebrali. Rimuovere il bulbo olfattivo in questa fase. Fai un taglio coronale un millimetro anteriormente al genu del corpo calloso e rimuovi i bulbi olfattivi accessori, seguiti dalla separazione della corteccia prefrontale mediale e laterale.
Parzialmente tagliato orizzontalmente o coronalmente attraverso la porzione trasversale della commissura anteriore dalla linea mediana sotto il corno anteriore del ventricolo laterale per liberare il nucleo del setto dorsalmente e lo striato ventrale ventralmente. Rimuovere la piccola quantità di corteccia dalla superficie laterale per rimuovere la soccombenza del nucleo e il tubercolo olfattivo. Separare la porzione rostrale del corpo striato dalla corteccia sovrastante tramite un bisturi curvo tagliato appena fuori dalla capsula esterna.
Identificare i nuclei del setto o del setto e isolarli da questa sezione. Fai un taglio curvo per separare l'ipotalamo in questo passaggio. Questo sarà fatto usando un taglio coronale parziale posteriore ai corpi mammillari che si estende solo lateralmente fino al solco ipotalamico.
Quindi liberare la sezione trasversale dell'ipotalamo con un taglio parasagittale lungo la lunghezza del solco ipotalamico. Estromettere il ventricolo laterale per rivelare ulteriori connessioni intralimbiche nei restanti componenti del sistema limbico. Nella parte interna della corteccia interna, si osserva una struttura simile a un ventaglio dopo l'apertura del ventricolo.
Utilizzare la struttura a ventaglio nella corteccia entorinale per definire i margini ai fini della dissezione, quindi identificare e rimuovere l'amigdala, la corteccia entorinale, la corteccia cingolata posteriore e l'ippocampo. Confermare l'identificazione del talamo mediante la visualizzazione della stria midollare sulla sua superficie dorsale che si estende nel piano corticale rostrale della linea mediana. Separare completamente il talamo dal mesencefalo con un taglio coronale.
Questo protocollo può essere utilizzato per la rimozione immediata del cervello dal cranio, seguita dalla dissezione. I tessuti sezionati possono essere conservati e lavorati in seguito a seconda delle esigenze dello studio. L'RNA estratto da più tessuti sezionati può essere analizzato per l'espressione genica.
I risultati rappresentativi sono stati ottenuti utilizzando cervelli raccolti che sono stati conservati a meno 80 gradi Celsius per diversi mesi prima dell'estrazione dell'RNA. Regioni cerebrali distinte insieme a dati di peso sono stati raccolti nell'ambito del modello di stress sociale esposto all'aggressore dello studio di PTSD. Le concentrazioni di RNA e le letture spettrofotometriche sono mostrate qui.
Quando si segue questo protocollo, assicurarsi che i tessuti siano sempre raffreddati mantenendo il cervello su un blocco di acciaio ghiacciato e bagnando periodicamente il tessuto con soluzione salina ghiacciata. Una volta che i tessuti vengono raccolti e immediatamente congelati, possono essere utilizzati per saggi come trascrittomica, metabolomica e proteomica in un secondo momento.
