Siamo grati ad Austin Ferro e Juao-Guilherme Rosa nel laboratorio Cvetanovic per il loro aiuto nella risoluzione dei problemi delle dissezioni e nell'estrazione dell'RNA e RTqPCR. Questa ricerca è finanziata da M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS National Institutes of Health (NIH).

1. Configurazione
<ol><li>Raccogli l'attrezzatura necessaria tra cui forbici di decapitazione, pinza smussata, forbici di dissezione, forbici vascolari, microspatula, matrice cerebrale di topo sagittale, lame di rasoio, punte di pipet da 200 μL, piastra di Petri di vetro, vetrino di vetro e secchiello del ghiaccio. Disadere tutte le attrezzature su un pad assorbente.</li>
	<li>Metti la capsula di Petri, la lastra di vetro e la matrice cerebrale sul ghiaccio.</li>
	<li>Utilizzando una lama di rasoio con un angolo perpendicolare, tagliare circa 5 mm dalla punta di una punta di pipetta da 200 μL. Ciò rende la dimensione dell'apertura all'estremità della punta larga circa 1 mm. Questo dovrebbe essere sufficiente per eliminare il DCN. Ma questo può anche essere regolato secondo necessità a seconda della dissezione. Avere molti suggerimenti pronti per una facile sostituzione e regolazione.</li>
	<li>Etichetta 1,5 mL di tubi per microfughe con identificazione animale e regione cerebellare (quattro tubi per animale).</li>
	<li>Riempire il contenitore criosafe con azoto liquido per congelare il tessuto dopo l'estrazione.</li>
</ol>2. Estrazione e dissezione del cervello
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida dei comitati per la cura degli animali dell'Università del Minnesota.
<ol><li>Eutanasia del mouse utilizzando il 5% di esposizione a CO2. Una volta che la respirazione è cessata, eseguire la lussazione cervicale. Decapitare il topo con le forbici di decapitazione e scartare la carcassa nell'apposito recipiente.</li>
	<li>Fai un'incisione con una lama di rasoio lungo la linea sagittale mediale della testa partendo dal naso e continuando fino in fondo. Separare la pelle, separandosi su entrambi i lati della linea mediana. Usa la lama del rasoio per tagliare via il muscolo su ciascun lato, tagliando oltre i canali uditivi.</li>
	<li>Usando le forbici sezionanti, tagliare tutte le regioni del midollo spinale, fino a dove il tronco cerebrale incontra il cervelletto, facendo attenzione a non danneggiare il cervelletto.</li>
	<li>Inserire una delle lame vascolari a forbice nello spazio tra il tronco cerebrale e la colonna vertebrale e tagliare verso il condotto uditivo, sollevando le forbici per tagliare in modo pulito l'osso ma limitare i danni al tessuto.</li>
	<li>Continuare a tagliare lungo il bordo del cranio verso i bulbi olfattivi, continuando a sollevarsi mentre si taglia per limitare i danni al tessuto cerebrale.</li>
	<li>Usando la pinza smussata, staccare delicatamente la parte posteriore del cranio scoprendo la regione posteriore del cervello e del cervelletto.</li>
	<li>Usando la pinza smussata lungo il bordo del cranio che è stato appena tagliato, sbuccia il resto del cranio su e sopra il cervello. Questo passaggio dovrebbe rimuovere la maggior parte della calotta cranica, rivelando il cervello.</li>
	<li>Taglia il resto del cranio con le forbici vascolari e la pinza smussata, liberando la maggior parte del cranio dalla parte superiore del cervello.</li>
	<li>Usando la microspatula, sollevare leggermente il cervello e raccogliere sotto e scivolare verso l'alto per rimuovere i bulbi olfattivi dal cranio rimanente e scollegare le fibre del tratto ottico. Il cervello dovrebbe liberarsi facilmente a questo punto.</li>
	<li>Metti il cervello nella capsula di Petri seduto sul ghiaccio e rimuovi qualsiasi cranio rimanente o altri detriti.</li>
	<li>Usando la microspatula, posizionare delicatamente il cervello nella matrice cerebrale con il lato dorsale in alto. Prenditi del tempo per assicurarti che sia impostato il livello nella matrice, in particolare che la linea mediana cada al centro della matrice. Questa matrice è progettata per il tessuto cerebrale di topo adulto, il tessuto di animali più giovani o malati può riposare più in basso nella matrice, ma dovrebbe essere ancora possibile ottenere risultati riproducibili su tutti i campioni.</li>
	<li>Posizionare una lama di rasoio lungo la linea mediana sagittale, assicurandosi che la lama spinga fino in fondo alla matrice (Figura 1B).</li>
	<li>Posizionare un'altra lama di rasoio di 1 mm sul lato della prima lama (Figura 1B). Posizionare altre due lame a 1 mm di distanza l'una dall'altra. Il risultato finale dovrebbe essere costituito da tre lame posizionate su un lato del cervello, tutte distanti 1 mm l'una dall'altra. Fai lo stesso con l'altra parte. In totale, 7 lame saranno posizionate a 1 mm di distanza (Figura 1C).</li>
	<li>Con attenzione, afferrare le estremità anteriore e posteriore delle lame di rasoio e sollevare direttamente dalla matrice. Il tessuto all'esterno delle lame di rasoio può essere scartato.</li>
	<li>Lentamente, separare una lama di rasoio alla volta dalle altre, facendo attenzione a non danneggiare le sezioni di tessuto.</li>
	<li>Far scorrere con attenzione la sezione di tessuto fuori dalla lama del rasoio e sul vetrino di vetro con la microspatula. In totale ci saranno sei sezioni cerebrali sagittali (Figura 1D).</li>
	<li>Le 4 sezioni più laterali avranno DCN visibile (scatola viola, Figura 1D). Per isolare il DCN, tenere la punta del pipetto da 200 μL tagliata perpendicolarmente sopra il DCN e spingere verso il basso attraverso il tessuto saldamente, oscillando in tutte le direzioni per sezionare completamente il DCN dal tessuto circostante. Sollevare direttamente per rimuovere in modo pulito il DCN e confermare visivamente la presenza del tessuto nella punta.</li>
	<li>Posiziona un dito nella parte superiore della punta e spingi verso il basso, causando il rigonfiamento del tessuto. Posizionare la punta in un tubo di microfuga correttamente etichettato e assicurarsi che il punzone di tessuto sia posizionato sul fondo del tubo. Ripetere 2.17 per le restanti tre sezioni, posizionando i punzoni DCN nello stesso tubo. Posizionare il tubo in azoto liquido per congelare il flash. Rappresentazione della dimensione di ciascun punzone nella Figura 1E.</li>
	<li>Le sezioni che hanno estratto DCN si qualificano come emisfero cerebellare. Spingere via il resto del tessuto cerebrale intorno al cervelletto in queste sezioni. Utilizzare una pinna smussata e raccogliere delicatamente queste sezioni della corteccia cerebellare dell'emisfero e posizionarle nel rispettivo tubo del microfugo. Blocco flash.</li>
	<li>Per le ultime due sezioni vermali (scatola azzurra, Figura 1D),allontanare il tessuto cerebrale circostante lasciando solo il cervelletto. Usando una lama di rasoio, fai un taglio separando i lobuli anteriori dai lobuli posteriori. Il taglio dovrebbe essere subito dopo la formazione del lobulo 6 e non dovrebbe includere il lobulo 10 (Figura 1F).</li>
	<li>Utilizzando una pinna smussata, posizionare con attenzione le sezioni della corteccia cerebellare anteriore e le sezioni della corteccia cerebellare posteriore nei rispettivi tubi del microfugo e congelare il flash lasciando i tubi in azoto liquido per 5 minuti. Da qui passare all'estrazione dell'RNA, o si possono conservare i tubi a -80 °C.</li>
</ol>3. Estrazione dell'RNA 
NOTA: Questo protocollo è stato modificato dal protocollo Cold Spring Harbor per l'estrazione dell'RNA con TRIzol20. TRIzol solubilizza il materiale biologico, rendendo possibile l'estrazione dell'RNA.
<ol><li>Posizionare i tubi del microfugo nel ghiaccio per evitare che il tessuto si scongeli troppo rapidamente, applicare 150 μL di TRIzol freddo nel tubo del microfugo. Omogeneizzare con un pestello sterilizzato. Una volta che il tessuto è omogeneizzato, pipettare la soluzione su e giù per assicurarsi che non vi sia tessuto rimanente intatto. Rompere ulteriormente eventuali piccoli pezzi di tessuto tirandolo su in una siringa da insulina un paio di volte.</li>
	<li>Aggiungere altri 350 μL di TRIzol e pipettare su e giù per mescolare accuratamente. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 5 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 150 μL di cloroformio al tubo e agitare vigorosamente e quindi lasciare riposare per 2-3 minuti. Il cloroformio separa la soluzione tissutale omogeneizzata in fasi (RNA, DNA e proteine).</li>
	<li>Centrifugare a 12.000 x g, a 15°C, per 10 minuti. Assicurarsi che tutti i tubi siano allo stesso orientamento.</li>
	<li>Rimuovere con cura i tubi e impostare la temperatura della centrifuga a 4°C. Rimuovere solo la fase acquosa chiara in un nuovo tubo (questo è l'RNA), facendo attenzione a non interrompere l'interfase opaca (il DNA).  La fase più bassa sarà rossa e contiene proteine. La soluzione rimanente nei tubi può essere salvata o scartata.</li>
	<li>Aggiungere alcol isopropilico al 100% con un rapporto 1:2 (se rimosso 200 ul di fase acquosa, aggiungere 100 μL di alcol isopropilico). Mescolare accuratamente pipettando su e giù. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 10 minuti. L'alcol isopropilico fa precipitare l'RNA fuori dalla soluzione.</li>
	<li>Centrifugare a 12.000 x g, a 4°C, per 10 minuti. Assicurati di posizionare tutti i tubi con lo stesso orientamento per facilitare la visualizzazione del pellet. Il pellet risultante sarà l'RNA estratto.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione i tubi, rimuovere il surnatante con un pipetto facendo attenzione a non disturbare il pellet. Il pellet è un po 'gelatinoso e sarà difficile da vedere, ma dovrebbe essere in grado di stimare dove si basa sull'orientamento dei tubi nella centrifuga.</li>
	<li>Dopo aver rimosso tutto il surnatante, aggiungere 500 μL di etanolo al 75%, vortice brevemente e centrifugare a 7500 x g, a 4°C, per 5 minuti. L'etanolo lava ulteriormente il pellet.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante con attenzione, senza interrompere il pellet. Lasciare i tappi aperti per asciugare il campione. Questo di solito richiede 5-10 minuti, ma può variare a seconda di quanto etanolo è rimasto sul pellet. Non asciugare troppo.</li>
	<li>Una volta asciutto, risusciughare il pellet in acqua priva di DNase. Aggiungere 20 μL ai campioni per DCN e 30 μL per tutti gli altri.</li>
	<li>Una volta ripresa, i campioni possono essere conservati a -80 °C o procedere a ulteriori test.</li>
</ol>4. Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RTqPCR)
<ol><li>Prima di questo passaggio sarà necessario trattare DNase l'RNA per rimuovere qualsiasi DNA genomico e generare cDNA utilizzando iScript da BioRad. Assicurati di normalizzare la concentrazione di RNA prima di produrre il cDNA. Inoltre, è importante ottimizzare i primer per qPCR. Seguire i metodi descritti qui per completare questo passaggio21. Breve descrizione del qPCR di seguito.</li>
	<li>I primer sono tutti acquistati da IDT. Le sequenze avanti e indietro sono entrambe nella stessa provetta del campione e conservate a una concentrazione di 20 volte superiore. Rps18 (gene di controllo): Avanti – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3' Inverso – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3' Parvalbumina (Proteina legante il calcio, cellule inibitorie): Avanti – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3' Inverso – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3' Kcng4 (Subunità del canale del potassio): Avanti – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3' Inverso – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3' Aldolasi C (Zebrina II, espressa in modo differenziale attraverso la corteccia cerebellare): Avanti – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3' Inverso – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3'</li>
	<li>Le condizioni qPCR erano le seguenti. Periodo di pre-incubazione, 5 minuti, a 95°C. Periodo di amplificazione, 50 cicli: 10 minuti a 95°C, 10 minuti a 62°C e 10 minuti a 72°C. Periodo della curva di fusione, 5 secondi a 95 °C, un minuto a 65 °C e impostare la velocità di rampa su 0,07 °C/secondo fino alla temperatura target di 97 °C. Quindi periodo di raffreddamento per 10 minuti a 40 ° C.  Tutte le reazioni qPCR sono state eseguite in triplice copia e l'espressione genica è stata analizzata utilizzando 2- ΔΔCt con Rps18 come controllo del carico per normalizzare l'espressione genica. L'estratto cerebellare sfuso è stato usato come riferimento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia/neuron+ratio:+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution.">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li><li>Schmahmann, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+regional+cerebellar+atrophy+in+genetic+frontotemporal+dementia.">Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia.</a> NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).</li><li>Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum.">Cerebellum.</a> The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).</li><li>Nguyen-Minh, V. 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H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglia+contribute+to+the+pathogenesis+of+spinocerebellar+ataxia+Type+1+(SCA1)+in+a+biphasic,+stage-of-disease+specific+manner.">Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner.</a> Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).</li><li>Chopra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Capicua+expression+drives+regional+Purkinje+neuron+vulnerability+through+ion+channel+gene+dysregulation+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Human Molecular Genetics. , (2020).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo qui descritto consente di valutare l'espressione genica sottostante e i meccanismi molecolari all'interno di quattro distinte regioni cerebellari: i nuclei cerebellari profondi (DCN), la corteccia cerebellare anteriore del verme (CCaV), la corteccia cerebellare posteriore del verme (CCpV) e la corteccia cerebellare degli emisferi (CCH). La capacità di valutare queste regioni separatamente amplierà la nostra conoscenza dell'eterogeneità di specifiche regioni cerebellari e possibilmente farà luce sul loro con...

Il cervelletto contiene oltre la metà dei neuroni nel cervello ed è stato storicamente indicato come un centro di controllo motorio e di equilibrio nel cervello1. Più recentemente, gli studi hanno dimostrato che il cervelletto svolge un ruolo chiave in varie altre funzioni tra cui la cognizione, l'elaborazione della ricompensa e l'influenza2,3,4,5.
Il cervelletto ha un'anatomia ben descritta: la regione della corteccia è composta da granuli, Purkinje e strati molecolari. Le cellule del granulo formano lo strato cellulare del granulo e inviano input tramite fibre parallele ai dendriti della cellula di Purkinje dello strato molecolare che ricevono anche input da fibre rampicanti che hanno avuto origine nell'oliva inferiore. Le cellule di Purkinje inviano proiezioni inibitorie alle cellule nei nuclei cerebellari profondi (DCN), che funge da output principale dal cervelletto. L'uscita di questo circuito cerebellare è ulteriormente modulata dall'attività degli interneuroni inibitori nella corteccia cerebellare, comprese le cellule di Golgi, stellate e cesto4. Questa unità funzionale cerebellare è distribuita in tutti i lobuli della corteccia cerebellare. Nonostante questo circuito relativamente uniforme attraverso il cervelletto, le prove della letteratura di neuroimaging umano e degli studi sui pazienti indicano l'eterogeneità funzionale del cervelletto6,7.
La corteccia cerebellare può essere divisa in due regioni principali: il verme definito dalla linea mediana e gli emisferi laterali. Il verme può essere ulteriormente diviso in lobuli anteriori e posteriori. Queste regioni distinte del cervelletto sono state implicate nel contribuire a comportamenti diversi. I modelli di attività evocati o privi di compiti implicavano che le regioni anteriori del verme contribuiscono maggiormente alla funzione motoria mentre il verme posteriore contribuisce maggiormente alla cognizione6,7. Il verme è anche legato agli affetti e alle emozioni, mentre gli emisferi cerebellari contribuiscono alle funzioni esecutive, visivo-spaziali, linguistiche e altre funzioni mnemoniche8. Inoltre, studi anatomici hanno fornito prove che regioni cerebellari funzionalmente distinte sono collegate a diverse regioni corticali9. La mappatura delle lesioni-sintomi ha rivelato che i pazienti con ictus che colpiscono i lobuli anteriori (che si estendono nel lobulo VI) hanno avuto prestazioni più scarse nei compiti motori fini, mentre i pazienti con danni alle regioni del lobo posteriore e agli emisferi hanno mostrato deficit cognitivi in assenza di sindrome motoria cerebellare10. Infine, la patologia cerebellare regionale nella malattia indica che le regioni cerebellari funzionalmente distinte sono anche diversamente suscettibili alla malattia11,12.
Sebbene molto meno esplorate, le prove preliminari dimostrano firme di espressione genica distinte tra le regioni corticali cerebellari. L'espressione cellulare di Purkinje di Zebrin II mostra un pattern specifico della regione nel verme tale che ci sono più cellule positive di Zebrina II nei lobuli posteriori e meno nei lobuli anteriori13. Ciò è anche correlato con la funzione fisiologica distinta a livello regionale in quanto le cellule di Purkinje negative di Zebrin II mostrano una maggiore frequenza di attivazione tonica rispetto alle cellule di Purkinje che sono Zebrin IIpositive 14.
Oltre alla corteccia cerebellare, il cervelletto comprende i nuclei cerebellari profondi (DCN) che fungono da output primario per il cervelletto. I nuclei sono costituiti dai nuclei mediali (MN), interposti (IN) e laterali (LN). L'imaging funzionale e gli studi sui pazienti hanno dimostrato che il DCN partecipa anche a vari comportamenti15, ma pochissimi studi esaminano il cambiamento dell'espressione genica nel DCN.
I progressi nelle tecniche molecolari hanno permesso di valutare l'espressione genica regionale nel cervello e hanno scoperto l'eterogeneità tra e all'interno di diverse regioni del cervello sia negli stati fisiologici che in quelli patologici16. Tali studi implicano che il cervelletto è diverso dalle altre regioni del cervello. Ad esempio, il rapporto tra neuroni e cellule gliali è invertito nel cervelletto rispetto ad altre regioni del cervello1. Anche in condizioni fisiologiche normali, l'espressione dei geni proinfiammatori è sovraregolata nel cervelletto rispetto alle altre regioni cerebrali17. Le tecniche molecolari sono state anche molto utili nell'identificare le vie che contribuiscono alla patogenesi delle malattie cerebellari. Ad esempio, il sequenziamento dell'RNA di interi estratti cerebellari ha identificato geni alterati in un modello murino transgenico specifico della cellula di Purkinje di atassia spinocerebellare di tipo 1 (SCA1) rispetto ai loro controlli di tipo selvaggio. Tali evidenze hanno rivelato percorsi molecolari chiave alla base della patogenesi nelle cellule cerebellari di Purkinje e hanno contribuito a identificare potenziali bersagli terapeutici18. Tuttavia, studi recenti suggeriscono che ci sono differenze nella vulnerabilità alle malattie tra le regioni cerebellari11,12,19. Ciò potrebbe indicare che ci sono cambiamenti chiave che si verificano in regioni cerebellari distinte, che possono essere mascherate o non rilevate con interi estratti cerebellari. Pertanto, è necessario sviluppare tecniche che consentano ai ricercatori di esaminare i profili molecolari in diverse regioni cerebellari.
La tecnica qui proposta descrive un metodo riproducibile per sezionare quattro regioni distinte del cervelletto di topo al fine di isolare l'RNA da quelle regioni ed esplorare le differenze regionali nell'espressione genica. Lo schema del cervelletto del topo nella Figura 1A evidenzia il verme in blu e gli emisferi in giallo. Nello specifico, questa tecnica permette di isolare quattro regioni: i nuclei cerebellari profondi (DCN) (scatole tratteggiate di rosso in Figura 1A),la corteccia cerebellare del verme anteriore (CCaV) (blu scuro in Figura 1A),la corteccia cerebellare del verme posteriore (CCpV) (azzurro in Figura 1A),e la corteccia cerebellare degli emisferi (CCH) (gialla in Figura 1A). Valutando separatamente l'espressione genica di queste regioni, sarà possibile studiare i meccanismi molecolari alla base delle funzioni discrete di queste diverse regioni, nonché le potenziali differenze nella loro vulnerabilità alla malattia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 Microcentrifuge tubes</td>
			<td >ThermoScietific</td>
			<td >3456</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% Isopropyl Alcohol</td>
			<td >VWR Life sciences</td>
			<td >1106C361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 ul Pipet tips</td>
			<td >GeneMate</td>
			<td >P-1237-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td>
			<td >Kent Scientific Corporation</td>
			<td >RBMA-200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blunt forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Macron</td>
			<td >220905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Decapitation Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl Alcohol</td>
			<td >Pharmco</td>
			<td >111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Slide (for electrophoresis)</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Homogenizer</td>
			<td >Kimble</td>
			<td >6HAZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ice Bucket</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulin Syringe (.5ml)</td>
			<td >BD</td>
			<td >329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td >1725037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Spatula</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle Nose forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri Dish</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Aldolase C</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58&#62;43415246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Kcng4</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.56a.9448518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Parvalbumin</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.7596729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer Rps18&#160;</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.12109666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Edge Rzor Blades</td>
			<td >Personna GEM</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, sigle-use pestles</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12141364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol Reagent</td>
			<td >Ambion by Life technologies</td>
			<td >15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vascular Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

Il cervelletto svolge un ruolo importante in diverse funzioni chiave tra cui il controllo del movimento, l'equilibrio, la cognizione, la ricompensa e l'affetto. Studi di imaging indicano che regioni cerebellari distinte contribuiscono a queste diverse funzioni. Gli studi molecolari che esaminano le differenze cerebellari regionali sono in ritardo in quanto sono per lo più eseguiti su estratti cerebellari interi, mascherando così qualsiasi distinzione tra specifiche regioni cerebellari. Qui descriviamo una tecnica per sezionare in modo riproducibile e rapido quattro diverse regioni cerebellari: i nuclei cerebellari profondi (DCN), la corteccia cerebellare vermale anteriore e posteriore e la corteccia cerebellare degli emisferi. Sezionare queste regioni distinte consente l'esplorazione di meccanismi molecolari che possono essere alla base dei loro contributi unici all'equilibrio, al movimento, all'affetto e alla cognizione. Questa tecnica può anche essere utilizzata per esplorare le differenze nella suscettibilità patologica di queste regioni specifiche in vari modelli di malattia murina.

Per questi esperimenti sono stati utilizzati quattro topi femmina di tipo C57/Black6 di undici settimane. Un topo è stato utilizzato per condurre una dissezione cerebellare completa che viene definita "cervelletto di massa" e ha permesso il confronto dei livelli di RNA nelle regioni sezionate con una dissezione completa. Gli altri tre topi sono stati utilizzati per condurre la dissezione cerebellare descritta in questo protocollo. L'utilizzo di tre topi consente di garantire che le tende...

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Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Diverse regioni cerebellari sono state implicate per svolgere un ruolo in distinti output comportamentali, ma i meccanismi molecolari sottostanti rimangono sconosciuti. Questo lavoro descrive un metodo per sezionare in modo riproducibile e rapido la corteccia cerebellare degli emisferi, delle regioni anteriori e posteriori del verme e dei nuclei cerebellari profondi al fine di sondare le differenze molecolari isolando l'RNA e testando le differenze nell'espressione genica.

Dissezione regionale cerebellare per l'analisi molecolare

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

cerebellar-regional-dissection-for-molecular-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K Views.  University of Minnesota. Diverse regioni cerebellari sono state implicate per svolgere un ruolo in distinti output comportamentali, ma i meccanismi molecolari sottostanti rimangono sconosciuti. Questo lavoro descrive un metodo per sezionare in modo riproducibile e rapido la corteccia cerebellare degli emisferi, delle regioni anteriori e posteriori del verme e dei nuclei cerebellari profondi al fine di sondare le differenze molecolari isolando l'RNA e testando le differenze nell'espressione genica...

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A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously published phenotype assessments in several disease models, including spinocerebellar ataxias, Huntington s disease and spinobulbar muscular atrophy. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. Each measure is recorded on a scale of 0-3, with a combined total of 0-12 for all four measures. The results effectively discriminate between affected and non-affected individuals, while also quantifying the temporal progression of neurodegenerative disease phenotypes. Measures may be analyzed individually or combined into a composite phenotype score for greater statistical power. The ideal combination of the four described measures will depend upon the disorder in question. We present an example of the protocol used to assess disease severity in a transgenic mouse model of spinocerebellar ataxia type 7 (SCA7).
Albert R. La Spada and Gwenn A. Garden contributed to this manuscript equally.

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebellar ataxia. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. This protocol effectively discriminates between affected and non-affected individuals, and detects the progression of affected individuals over time.

Un semplice composito Sistema di punteggio per la valutazione Fenotipo modelli murini di atassia cerebellare

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Ricerca

Neuroscienze

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotipica Culture cerebellare: sfide apoptotiche e rilevamento

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Singolo Drosophila Ommatidium Dissection e Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissezione, Cultura, e analisi di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tessuto embrionale della retina

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissezione del muscolo Transversus Abdominis per l'analisi della giunzione neuromuscolare a montaggio intero

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser nanochirurgia di cerebellari Assoni<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...