Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Istituto per la Ricerca e l&#39;Innovazione in Biomedicina (IRIB), la piattaforma di imaging cellulare della Normandia (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, l&#39;Università di Rouen, il Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR - PERENE, Interreg 4A), il LARC-Neuroscienze di rete e la regione Alta Normandia.

Animali (maschi o ratti Wistar femmine) sono nati e allevati in una struttura accreditata animali (approvazione B.76-451-04), secondo la guida francese per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. Gli esperimenti sono stati condotti sotto la supervisione di ricercatori autorizzati (MB, DV e LG), in conformità con la Direttiva Europea del Consiglio della Comunità (2010/63 / UE del 22 settembre 2010) e del Ministero dell&#39;Agricoltura francese. 1. Preparazione di mezzi e strumenti <ol><li> In un armadio di sicurezza biologica, preparare BSS di 1x Hank (HBSS) in acqua sterile da 10x soluzione madre contenente CaCl 2 (1,85 g / l) / MgSO 4 (0,9767 g / l), senza MgCl 2. Aggiungere NaHCO3 (350 mcg / ml) a 1x soluzione di HBSS. </li><li> In un armadio di sicurezza biologica, aggiungere N2 supplemento (da una soluzione madre 100x) e la penicillina (100 unità / ml) -streptomycin (0,1 mg / ml) soluzione per mezzo aquila modificato (DMEM) mix nutriente Dulbeccoture F-12 (1: 1). </li><li> In condizioni sterili, preparare una aliquota (25 microlitri, 2 mM) del citoplasmatico colorante fluorescente cosiddetto Cell Tracker verde in DMSO (1.075 ml di 1 mg). Diluire un&#39;aliquota in 5 ml di DMEM in un tubo da 15 ml. </li><li> Preparare riempito portaghiaccio per mantenere i media a 4 ° C. </li><li> Decontaminare parti superiori del banco di laboratorio e gli strumenti con il 70% di etanolo. </li></ol> 2. La dissezione di cervelletto di ratti P10 <ol><li> Rapidamente decapitare cuccioli di ratto (P10) con le forbici curve di funzionamento dietro le orecchie, al fine di ottenere l&#39;inizio del midollo spinale. </li><li> Al lato posteriore della testa decapitata, fare mediana incisione della pelle dal collo al naso con iris belle forbici e separare la pelle dal cranio con iris belle forbici e Dumont # 3 pinze. </li><li> Usare bene le forbici iris per fare delicatamente due incisioni laterali dalla base alla regione rostrale del cranio. Rimuovere il teschio sezionato con due # 3 pinze. Staccare il reggisenoin qualsiasi aderenza con il cranio con le stesse pinze. </li><li> Trasferire il cervello con l&#39;estremità di un cucchiaio spatola per capsula di Petri (Ø 35 mm) contenente 2 ml di ghiacciata HBSS medio. </li><li> Mettere la piastra di Petri contenente il cervello in una capsula di Petri grande (Ø 100 mm) pieno di ghiaccio e trasferimento alla fase dello stereomicroscopio. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio, isolare il cervelletto dal cervello da dilacerazione utilizzando due # 3 pinze. Analogamente, rimuovere il midollo spinale residuo e la piale-membrana. </li><li> Trasferire il cervelletto in un nuovo piatto di Petri HBSS-riempita (Ø 35 mm, 2 ml) con la fine cucchiaino di una spatola e tenere in ghiaccio. </li></ol> 3. Preparazione di acuta cerebellari fette <ol><li> Sotto lo stereomicroscopio, tagliare il cervelletto tra verme e l&#39;emisfero destro come indicato dalle due teste freccia in figura 2A con uno standard manico bisturi # 3 solido e una lama chirurgica # 15. </li><li> Mettere una goccia di cianocolla oacrylate sul disco dei campioni vibratome e aspettare 15-25 secondi per eliminare vapori di solventi tossici. </li><li> Raccogliere il cervelletto taglio con l&#39;estremità cucchiaino di una spatola e rimuovere l&#39;eccesso HBSS con tovaglioli di carta puliti. </li><li> Portare il cervelletto vicino al disco di preparato. Fissare il bordo tagliato al disco campione e attendere 10 secondi. </li><li> Inserire il disco di preparato nel vassoio buffer con il manipolatore, e ruotarla in modo all&#39;asse trasversale del cervelletto è perpendicolare al portalama. Fissare il disco di preparato con una chiave a brugola e riempire con delicatezza il vassoio buffer con HBSS medio fino a quando il cervelletto è coperto. </li><li> Carico ghiaccio tritato nel bagno di raffreddamento. </li><li> Pulire i tre volte lama con il 70% di etanolo per eliminare l&#39;olio. </li><li> Inserire la lama nel porta-lama e fissarlo con la vite di fissaggio. </li><li> Posizionare il bordo destro della lama dietro il bordo posteriore (dal punto di vista dell&#39;utente) del campione e definire come punto di partenza. Utilizzare avanti comando per definire tegli punto finale dopo il bordo anteriore del campione. </li><li> Selezionare sezionamento velocità a 2,5 e sezionamento frequenza 8. Selezionare lo spessore di taglio a 180 micron. Avviare sezionamento dei tessuti. </li><li> Pick up ogni sezione con un bicchiere ampio tunnel troncato pipetta Pasteur e trasferimento in HBSS contenenti capsula di Petri (Ø 35 mm) tenuti in ghiaccio. </li><li> Utilizzando due # 5 pinze, rimuovere le meningi accuratamente dal cervelletto quando interferire con la lama. Raccogliere un massimo di 5 fette al cervelletto (Figura 2B, C). </li><li> Rimuovere le meningi dalle fettine cerebellari accuratamente con due # 5 pinze allo stereomicroscopio e separare i lobuli dolcemente per meglio sonda carico. </li></ol> 4. fluorescente colorazione delle condizioni di vita Interneuroni <ol><li> Trasferimento fette cerebellare con una pipetta Pasteur di vetro ampio tunnel troncato a un 6-pozzetti (max 3 fette / per pozzetto). Aspirare il mezzo HBSS. </li><li> Incubare fette (3 max) in 5 ml di lsoluzione oading del colorante fluorescente (10 mM). </li><li> Per proteggere dalla luce, coprire la micropiastra con un foglio di alluminio. Mettere su un tavolo giroscopio-mobile a 35 rpm per 10 minuti a RT per facilitare marcatura delle cellule. </li><li> Fette di trasferimento sulla membrana di un Transwell inserto (3,0 micron dimensione dei pori; Figura 2D) con una pipetta Pasteur di vetro wide-bore troncato. Aspirare il mezzo carico con pipetta. </li><li> Togliere l&#39;inserto e riempire il pozzo con 1,9 ml di DMEM. Sostituire l&#39;inserto e aggiungere 100 ml di DMEM sulla parte superiore della fetta per coprire il tessuto. </li><li> Posizionare la piastra contenente gli inserti culturali nella camera incubatrice (37 ° C, 5% di CO 2) per 2 ore, che è sufficiente osservare GC in ML. Lie tessuti piane per consentire attacco sulla membrana inserto (figura 2E). Assicurarsi che le fette non stanno asciugando. </li></ol> 5. ex vivo Imaging Attraverso confocale macroscopia <ol><li> Trasferire il piatto senzail coperchio di plastica in un incubatore fissare al supporto di un macroscope confocale. Mettere un coperchio di vetro sull&#39;inserto piatto del macroscopio. Mantenere la temperatura della camera a 37,0 ° C ± 0,5 ° C, e forniscono le fette con flusso di gas costante (95% O 2, 2 5% CO) attraverso i portapiatti per mantenere costante il pH. Attendere per 2 ore supplementari prima dell&#39;esperimento time-lapse. </li><li> Per visualizzare la distanza di migrazione GC nelle fettine di tessuto, illuminare la preparazione con una luce di lunghezza d&#39;onda 488 nm per mezzo di un diodo laser attraverso un macroscopio confocale a scansione laser dotata di un obiettivo a secco X2 (lavoro: 39 mm, diametro 58 mm, NA = 0,234), e rilevare emissione di fluorescenza 500-530 nm. <ol><li> Per risolvere finemente il movimento di GC, acquisire immagini con un ulteriore fattore di zoom ottico di 1,5-2,0. Raccogliere immagini di GN in un singolo piano focale o fino a 10 differenti piani focali lungo l&#39;asse z ogni 30 min fino a 12 ore. </li></ol></li&gt; <li> Quando necessario, rimuovere il coperchio di vetro e aggiungere piccoli volumi (1-10 microlitri) di attivatori biologici o inibitori in DMEM con una pipetta 10 microlitri di studiare il loro effetto sulla migrazione GC. </li></ol> Monitoraggio 6. cellulare <ol><li> Per ogni volta del film, effettuare z-stack proiezione attraverso la modalità Ecart-tipo in ImageJ. Modulare il contrasto ei livelli di luminosità delle immagini successive per facilitare l&#39;identificazione e la tracciabilità di GC etichettati. Mappa manualmente ogni posizione dell&#39;istantanea riferimento (t = 0). <ol><li> Utilizzare il plugin &quot;traccia manuale&quot; nel menu di particelle Analizzare e determinare cliccando sul punto di gravità di ogni cellula del corpo durante time-lapse. Esportare i dati di tracciamento grezzi in un foglio di calcolo. </li></ol></li><li> Riorganizzare i dati di tracciamento prime esportate da ImageJ con un programma intelligente fatta in casa (http://primacen.fr, scritto in codice PHP) che identifica ogni cellula e le posizioni associate. Utilizzando il programma, calculatall&#39;e la distanza totale percorsa e la velocità media di migrazione per ogni cella. Classificare e confrontare le caratteristiche della migrazione delle cellule in condizioni di controllo e di trattamento sotto opportuni filtri che utilizzano lo stesso programma. </li></ol>

<ol>
	<li>Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+in+the+Cerebellum.">Migration in the Cerebellum.</a> Cellular Migration and Formation of Neuronal Connections: Comprehensive Developmental Neuroscience. 2, 281-297 (2013).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).</li><li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+modes+of+neuronal+migration+in+different+domains+of+developing+cerebellar+cortex.">Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex.</a> Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).</li><li>Komuro, H., Yacubova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+cerebellar+granule+cell+migration.">Recent advances in cerebellar granule cell migration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).</li><li>Fahrion, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+neuronal+migration+deficits+in+a+mouse+model+of+fetal+Minamata+disease+by+increasing+neuronal+Ca2++spike+frequency.">Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency.</a> Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).</li><li>Raoult, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+(PACAP)+stimulates+the+expression+and+the+release+of+tissue+plasminogen+activator+(tPA)+in+neuronal+cells:+involvement+of+tPA+in+the+neuroprotective+effect+of+PACAP.">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP.</a> Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).</li><li>Cameron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+cortical-layer-specific+control+of+neuronal+migration+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide.">Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).</li><li>Renaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin-A2+and+its+ligand,+Sema6A,+control+nucleus-centrosome+coupling+in+migrating+granule+cells.">Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells.</a> Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).</li><li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+granule+cell+migration:+a+confocal+microscopic+study+in+acute+cerebellar+slice+preparations.">Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations.</a> Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).</li><li>Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(PACAP)+in+the+postnatal+and+adult+rat+cerebellar+cortex.">Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex.</a> Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).</li><li>Hannibal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+peptide+in+the+rat+central+nervous+system:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).</li><li>Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-type+plasminogen+activator+(tPA)+is+the+main+plasminogen+activator+associated+with+isolated+rat+nerve+growth+cones.">Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones.</a> Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).</li><li>Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+tissue+plasminogen+activator+mRNA+in+the+developing+rat+cerebellum+and+effects+of+inhibiting+tissue+plasminogen+activator+on+granule+cell+migration.">Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration.</a> Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).</li><li>Friedman, G. C., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+plasminogen+activator+mRNA+expression+in+granule+neurons+coincides+with+their+migration+in+the+developing+cerebellum.">Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum.</a> Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).</li><li>Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+extracellular+proteases+facilitate+cell+migration,+axonal+growth,+and+pathfinding.">Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding.</a> Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).</li><li>Basham, M. E., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+expression+in+the+neonatal+and+adult+mouse+brain.">Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain.</a> Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).</li><li>Bourgault, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+conformational+determinants+of+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+(PACAP)+for+activation+of+the+PAC1+receptor.">Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor.</a> Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive la cultura del P10 ratto fettine di cervelletto acute nel sistema Transwell e la marcatura fluorescente di GC con un colorante verde fluorescente per studiare la migrazione delle cellule durante lo sviluppo postnatale attraverso macroscopia confocale. Questo protocollo permette osservazioni della migrazione delle cellule per un periodo fino a 12 ore e le prove di possibili ruoli di fattori, tra cui la migrazione agonisti o antagonisti di neuropeptidi, inibitori dell&#39;enzima, segnalazione cellulare modulatori o sostanze tossiche durante l&#39;esperimento di regolazione. Un piccolo foro nell&#39;inserto membrana con un puntale è necessario per facilitare la somministrazione di composti nel mezzo di incubazione. Una curva puntale fatta in casa può essere utilizzato per facilitare la fornitura di soluzione. Una questione di studi di migrazione cellulare in viva fette di tessuto è che i movimenti del tessuto stesso può fare il monitoraggio difficili cellulare. Mentre gli approcci precedenti hanno proposto per stabilizzare dolcemente slices con una rete di nylon, o di un sottile strato di coda di ratto collagene 7,17, un importante vantaggio di questa tecnologia è la semplice e diretto trasferimento di una piastra di coltura a 6 pozzetti contenenti cerebellare fette su inserti membrana dal CO 2 incubatore all&#39;obiettivo di un macroscope confocale. Temperatura integrato e di CO 2 controller forniscono anche parametri ambientali adeguate e costanti essenziali per la migrazione delle cellule 9. Pertanto, condizioni di coltura sono mantenuti durante le osservazioni ed i movimenti dei tessuti sono ridotte al minimo in quanto le fette sono ben attaccati alla membrana inserto. Stabilizzazione del tessuto viene verificata seguendo la posizione dei bordi fetta o cellule di Purkinje che devono essere corretti riferimenti durante l&#39;acquisizione. Inoltre, fettine cerebellari (da 12 a 18) distribuiti nelle 6 pozzetti della piastra possono essere rapidamente osservati in dettaglio con un tavolino motorizzato ed uno zoom ottico. A causa della grande distanza di lavoro (X2, 39 mm) dell&#39;obiettivo secca, epi-osservazione è libera di immersione e somministrazione di composti nel mezzo di coltura è molto più facile. Pertanto, i parametri ambientali e le similitudini di sostegno della cultura di CO 2 incubatore e confocale macroscopia portano ad un massimo di conservazione del campione biologico. Un altro vantaggio del protocollo è il grande campo visivo e di conseguenza il numero di celle che possono essere osservati simultaneamente. Ad esempio, abbiamo precedentemente determinato che la densità di GC fluorescenti con migrazione radiale nella ML era 1124 ± 138 cellule / mm 2 18. Macroscopia confocale (X2, NA = 0,234) ha una risoluzione laterale inferiore rispetto alla microscopia confocale (40X, NA = 1.25), ma cellule corpi di GC possono essere facilmente monitorati e la velocità media delle migrazioni è comparabile tra i due approcci tecnologici 7,18 . Oltre miglioramento tecnico per le acquisizioni di immagini, la qualità di fette di tessuto e the la qualità dell&#39;etichettatura sono punti chiave per esperienze di successo. Tenere sempre i supporti e tessuti su ghiaccio durante i processi di dissezione, eliminare olio su vibratome lame e non utilizzare le fette di tessuto a contatto con la colla. Sezioni sagittali e trasversali sono adattati a radiali e tangenziali migrazione rispettivamente. Utilizzare diverse lunghezze di incubazione per il rilevamento appropriata nei diversi strati corticali del cervelletto. Tempi di incubazione lunghi (fino a 8 ore) sono necessari per rilevare la migrazione di numerosi GC nel PCL e il IGL. Dal momento che la migrazione GC è un processo fisiologico durante le finestre spazio-temporali specifici, il controllo positivo è che le cellule devono migrare correttamente. In particolare, numerosi GC mandrino nel ML è uno degli indici di salute principale per cerebellare fette sagittali. Per gli esperimenti di partenza, l&#39;osservazione dei movimenti GC nella ML è suggerito. Infatti, la forma di GC con corpo cellulare allungato verticalmente dovrebbe essere considerato come un punto di riferimento per avviare acquisizione con successivo controllo (2 ore) e trattamento (2 ore) periodi che possono essere facilmente eseguite nella ML. Coloranti fluorescenti, come la famiglia Tracker cellulare o proteine ​​fluorescenti espresse attraverso costrutti genetici possono essere utilizzati come traccianti per gli studi di migrazione cellulare. A causa delle cinetiche lente delle migrazioni GC (1 pila ogni 30 min), esperimenti multicolore possono essere eseguite in modo sequenziale dal 4 laser travi (405, 488, 532 e 633 nm) sono disponibili sul sistema. Considerando la migrazione radiale centripeta e centrifuga, il monitoraggio di altri interneuroni possono anche essere realizzati 18. In particolare, meno numerosi tipi di cellule possono essere facilmente localizzati con un ampio campo di vista. Infine, questo protocollo può essere usato per studiare la migrazione delle cellule in altri stadi di sviluppo cerebellare ma anche altre aree del cervello.

Nel cervelletto in via di sviluppo, otto diversi tipi di neuroni sono prodotti in sequenza tra la seconda settimana embrionale e la seconda settimana postnatale nei roditori 1. Provenienti inizialmente da una zona germinale primaria, granuli immaturi (GC) sono gli ultimi neuroni da produrre dallo strato esterno granulare (EGL), una zona germinale secondario 2. Durante le prime tre settimane postnatali, la corteccia cerebellare è una struttura lamellare organizzata in quattro strati tra cui la EGL, lo strato molecolare (ML), lo strato di Purkinje cella (PCL) e lo strato granulare interno (IGL) (Figura 1). Attraverso la migrazione centripeta, immaturo GC, interneuroni glutamatergiche, raggiungere la IGL entro circa 2 giorni. Con la terza settimana post-natale, la EGL scompare e l&#39;IGL costituisce il cosiddetto strato granulare (GL) nel cervelletto adulto. Nella GL, GC ricevere ingressi sinaptici eccitatori da fibre muschio e le cellule pennello unipolari, eingressi sinaptici inibitori di assoni delle cellule Golgi. Nel ML, assoni GC fanno sinapsi eccitatorie con i neuroni GABAergici, comprese le cellule di Purkinje, cellule cestino, cellule stellate e cellule Golgi 2. Osservazione in tempo reale di movimento delle cellule in fettine cerebellari acute ottenuti dai primi roditori postnatali dimostra che GCs modificano la loro forma in concomitanza con i cambiamenti nella modalità e la velocità di migrazione durante il loro percorso nella corteccia cerebellare 3. Nelle prime due settimane postnatali, precursori GC proliferano attivamente nella parte superiore della EGL. Nella parte centrale della EGL, postmitotici GC migrare tangenzialmente nella direzione del loro processo più ampio. Al confine EGL-ML, GC rallentare il loro movimento, le cellule iniziano a entrare in un processo breve discesa verticale nella ML. Nel ML, GC ha un corpo cellulare allungato in verticale, un processo finale sottile e un processo che porti più voluminoso, e migrano radialmente lungo le fibre gliali Bergmann. NelPCL, GC fermare il loro movimento, ma dopo una fase stazionaria prolungata (2 ore), che attraversano la frontiera PCL-IGL. Nel IGL, GC migrano verso il fondo dello strato in assenza di supporto in fibra gliale. Una volta che le punte del processo che conduce avvicinarsi al confine sostanza IGL-bianca (WM), GC lento e l&#39;arresto del movimento. Sezioni trasversali del cervelletto sono preferiti per studi sulle migrazioni tangenziali nel EGL mentre fette sagittali sono dedicati alla migrazione radiale nel ML, PCL e IGL. Alcuni fattori di regolamentazione dei movimenti GC compreso neuropeptidi (ad esempio, la somatostatina, PACAP) sono stati individuati finora, ma i meccanismi completi coinvolti nel controllo spazio-temporale delle migrazioni GC in ogni strato corticale sono ancora in gran parte sconosciute 1,4,5,6. Migrazione GC è stato studiato nel corso degli ultimi 20 anni attraverso video e microscopia confocale in illuminazione luce sia trasmessa per colture cellulari isolate o rivelazione a fluorescenza per acufettine cerebellari te. DII Inizialmente lipofile e, più recentemente &quot;Tracker cellulare&quot; coloranti e proteine ​​fluorescenti di cellule espresso sono stati utilizzati per confocale o microscopia a due fotoni 7,8. Esperimenti di successo dipendono da una serie di procedure specifiche che rendono il protocollo semplice ma non facile. In particolare, fette acuta devono essere stabilizzati durante le osservazioni generalmente con una fatta in casa di nylon della maglia della rete 9. L&#39;intensità di illuminazione luce deve essere la più bassa possibile per evitare fototossicità e photobleaching come proposto dalla scansione multipoint approccio microscopio confocale. Inoltre, la temperatura e CO 2 sono parametri ambientali da instabilità possono influire migrazione neuronale. Per facilitare e perfezionare le procedure sperimentali, abbiamo sviluppato un protocollo macroscopia confocale che limita i movimenti fetta, assicura parametri ambientali costanti, riduce photobleaching, aumenta il campo visivo (dell&#39;ordine di millimetri) e consequdipendentemente dal numero di cellule (decine) che possono essere monitorati mediante analisi dell&#39;immagine. Così, 180 micron fette spesse sono coltivate su inserti di membrana, e 6 pozzetti vengono trasferiti direttamente sotto un obiettivo motorizzato 2X di un macroscope confocale commerciale dotata di una grande camera di incubazione, la temperatura e CO 2 controller e un sistema di controllo delle vibrazioni. Time-decade e z-stack vengono poi effettuate per diverse ore e strumenti farmacologici o molecole bioattive possono essere aggiunti o consegnati nel mezzo di incubazione. Questo metodo potrebbe anche essere adattato per studiare la migrazione degli altri tipi di neuroni nel cervelletto o cerebrum a diversi stadi di sviluppo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution 10X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACAP38</td>
			<td>INRS, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Bourgault et al., 200919</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAI-1</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen</td>
			<td>O973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green CMFDA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Transwell-Clear inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture cluster</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 35 mm diameter</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100 mm diameter</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylen tube (15 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>E/0800DF/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biological safety cabinet fume hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MSC9 Class II A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adjustable-volume pipette (0,5-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gyro-rocker, SSL3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, Hera Cell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome, VT1000S</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal macroscope, TCS LSI</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature controller</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-controller</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope, M205 C</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors, curved, blunt/blunt</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>03.03.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>149090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 and #5 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11293-00 and 11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome injector blades/single edge</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39053250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard scalpel handle #3 solid</td>
			<td>FST</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical blade #15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of postnatal cerebellar granule cell migration using confocal macroscopy

Durante lo sviluppo postnatale, granuli immaturi (interneuroni eccitatori) mostrano migrazione tangenziale strato granulare esterno, e poi la migrazione radiale nello strato molecolare e lo strato di cellule di Purkinje per raggiungere lo strato granulare interna della corteccia cerebellare. Predefinito in processi migratori induce o morte cellulare o smarrimento dei neuroni, portando a deficit in diverse funzioni cerebellari. Migrazione cellulare granule centripeta coinvolge diversi meccanismi, come chemiotassi e degradazione della matrice extracellulare, per guidare le cellule verso la loro posizione finale, ma i fattori che regolano la migrazione delle cellule in ogni strato corticale sono solo parzialmente noti. Nel nostro metodo, fettine cerebellari acute sono preparati da P10 ratti, cellule granulari sono etichettati con un marcatore fluorescente e citoplasmatica tessuti sono coltivate su inserti membrana da 4 a 10 ore prima di iniziare il monitoraggio in tempo reale della migrazione cellulare da macroscopia confocale a 37 ° C nelpresenza di CO 2. Durante la loro migrazione nei diversi strati corticali del cervelletto, i granuli possono essere esposti agli agonisti o antagonisti neuropeptidi, gli inibitori della proteasi, antagonisti di effettori intracellulari o sostanze addirittura tossiche come alcol o metilmercurio per indagare il loro possibile ruolo nella regolazione della migrazione neuronale .

Nei primi anni del cervelletto postnatale, GC mostrano cambiamenti significativi nella loro modalità e la velocità di migrazione che attraversano diversi strati corticali 1 (Figura 1). Questa sezione illustra esempi di risultati che si possono ottenere attraverso lo studio della migrazione GC nel loro ambiente cellulare naturale. P10 ratto fette di tessuto cerebellare etichettati con un colorante fluorescente verde sono esaminati al macroscopio confocale (Figura 3A) e ci dimostrano che GC migrano radialmente in ML con una velocità media di 18 micron / ora (Figura 3B, C). Ad oggi, il ruolo delle interazioni / comunicazioni tra le cellule neuronali e gliali compresi i fattori normativi e meccanismi molecolari coinvolti nel controllo della migrazione delle cellule in ogni strato corticale sono in gran parte sconosciuti. Di conseguenza, il problema principale è quello di identificare neuropeptidi, neurotrasmettitori, neurotrofine e componenti della matrice extracellulare che potrebbero giocare un ruolo in questi corticale layer-specicambiamenti FIC della velocità durante il loro processo di migrazione. Ipofisi adenilato-ciclasi attivando polipeptide (PACAP) viene rilevata principalmente nel PCL, ma anche nella ML e l&#39;IGL durante le prime due settimane postnatali nel roditori 7,10,11. Applicazione PACAP38 (10 -6 M) al mezzo di coltura ha comportato una riduzione della velocità 79% della GC nella ML. Ad esempio, la velocità di migrazione di GC del ML sceso da 11,9 micron / hr in condizioni di controllo a 2,5 micron / hr dopo somministrazione di PACAP38 (Figura 4A). Tissue-tipo attivatore del plasminogeno (tPA) è un membro della cascata proteolitica che porta alla degradazione dei componenti della matrice extracellulare (EM), come ad esempio molecole di adesione cellulare o laminina 12,13. tPA e plasminogeno, un substrato di tPA, vengono rilevati in strati corticali durante lo sviluppo del cervelletto 14,15,16 postnatale. La somministrazione di PAI-1 (10 -7 M), un inibitore di tPA endogena, ridotto del 78% GCmigrazioni nella ML. Ad esempio, GC ridotta velocità di migrazione nel ML da 19,2 micron / hr in condizioni di controllo a 4,2 micron / hr dopo l&#39;aggiunta del PAI-1 (Figura 4B). Questi risultati indicano che PACAP esercita un effetto inibitorio diretta sui movimenti GC e che la serina proteasi tPA facilita la migrazione di GC nella ML del ratto sviluppo del cervelletto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig1.jpg" /> Figura 1: rappresentazione 3D della migrazione GC nella corteccia cerebellare postnatale. 1-4, estensione dei processi di GC e la migrazione tangenziale in EGL. 5, la migrazione radiale nella ML lungo Bergmann fibre gliali. 6, transitoria fase stazionaria nel PCL. 7, migrazione Glial indipendente radiale nel IGL. 8, completamento della migrazione GC nel IGL GC, cellule dei granuli, in rosso;. EGL, Strato granulare esterno; B, Bergmann glia, in viola scuro, G, cellule Golgi, in giallo, cf, fibre rampicanti, in azzurro, g, granuli postmigratory, in verde chiaro, IGL, strato granulare interno; mft, fibra di muschio terminale, in verde scuro, ML, strato molecolare, P, cellula di Purkinje, in viola chiaro, strato PCL, Purkinje cellule. Questo dato è stato modificato da 5. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig2.jpg" /> Figura 2: ex vivo cultura del P10 fettine cerebellari (A) cervelletto Dissected dal P10 di ratto.. Barra di scala = 6 mm. (B) Micrografia di vivere a 180 micron di spessore fetta cerebellare attraverso stereomicroscopia. Barra di scala = 3 mm. (C) Aun ingrandimento maggiore, i quattro strati corticali (EGL, ML, PCL, IGL) del cervelletto sono già distinguibili. Barra di scala = 1 mm. (D) Dopo la marcatura fluorescente, fette di tessuto sono collocati su inserti cultura (diametro 24 mm) in un 6-pozzetti. (E) Rappresentazione schematica di un inserto culturale con membrana in poliestere coltura di tessuti trattati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52810/52810fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig3.jpg" /> Figura 3: la migrazione dinamica dei CV negli strati corticali di ratto P10 cervelletto (A) Vista Macroconfocal (xyz, proiezione 2D) di una fetta cerebellare P10 ratto in cui GC sono etichettati con un colorante fluorescente verde citoplasmatica.. Barra di scala = 75 micron. (B) Time-lapse imaging mostra GCmovimenti nella ML di macroscopia confocale per 4 ore in condizioni di controllo. Asterisco (*) indica il simbolo soma GC. Tempo (in minuti) è indicato nella parte inferiore di ciascuna microfotografia. Barra di scala = 10 micron. (C) le modifiche sequenziali nella distanza percorsa dal GC soma. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig4.jpg" /> Figura 4:. Effetto del neuropeptide e proteasi inibitore della migrazione GC (A) GC è stata monitorata in ML da macroscopia confocale per 2 ore in condizioni di controllo e poi per 2 ore in presenza di Pituitary adenilato-ciclasi attivando polipeptide (PACAP). (B) GC è stata monitorata in ML da macroscopia confocale per 2 ore in condizioni di controllo e poi per 2 ore in presenza di inibitore dell&#39;attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1).

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Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo Imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare Utilizzando confocale macroscopia

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

9.3K Views.  Inserm, IRIB, University of Rouen. During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Video: Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

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Neuroscienze

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Topo romboencefalo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura per studiare la migrazione Branchiomotor Neuron viso

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

L&#39;esaurimento selettiva di microglia da cerebellare granuli colture cellulari Utilizzando L-leucina estere metilico

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

Valutazione della vitalità neuronale utilizzando la fluoresceina diacetato-propidium ioduro a doppia colorazione nel granulo cerebrale Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.