Name: long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants
Uploaded: 2014-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
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Grazie a Willy Sun per l&#39;assistenza tecnica e il Dr. Kris Gellynck per gli utili commenti e tre revisori anonimi per i loro consigli costruttivi. Questo lavoro è stato finanziato dalla udienza Regeneration Initiative Sunnybrook

Tessuto mouse è stato raccolto da Sox2 EGFP -reporter topi 12 mantenuti e eutanasia ai sensi del canadese sugli orientamenti per la cura degli animali per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. 1. Coltura embrionale coclee <ol><li> Supplemento Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) miscelando 8,89 ml di DMEM, 1 ml di siero fetale bovino (FBS), 100 ml di 100x N2 integratore, e 10 ml di 10 mg / ml ciprofloxacina. Supplemento soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) mescolando 495 ml HBSS con 5 ml di 100% HEPES. </li><li> Preparare vetro cultura fondo piatti: <ol><li> In una cappa a flusso laminare, risospendere 200 microlitri seminterrato estratto membrana substrato in 5 ml di DMEM. Preparare 35 millimetri di vetro del diametro di coltura fondo piatti con 10 mm di pozzi. Pipettare 150 ml di substrato / DMEM al centro di ogni piatto fondo di vetro. Questi piatti possono essere utilizzati dopo 40 minuti di incubazione, oppure possono memorizzare in un CO 2 </sub&gt; Incubatore a 35 ° C per almeno una settimana. NOTA: fondo trasparente piatti sono utilizzati per i seguenti motivi: per garantire che la base del piatto è trasparente e adatto per l&#39;imaging, per creare un pozzo nel centro del piatto che permette gli espianti di stabilirsi in una zona facilmente posizionato e infine in modo che dopo un esperimento il campione può essere trattati per immunoistochimica e successiva analisi. </li></ol></li><li> Preparare la stazione di lavoro e gli strumenti: <ol><li> Accendere il banco di lavoro pulito a flusso laminare, e spruzzare verso il basso con il 70% EtOH per creare uno spazio di lavoro pulito. Mettere a bagno pinze, cucchiai, e un nero 184 piatto elastomero di silicone (un mix di 184 elastomero di silicone (10 parti), il catalizzatore (1 parte) e polvere di carbone (2,5 g)), nel 70% EtOH. </li></ol></li><li> Nella stazione di lavoro pulita, embrioni di raccolta per l&#39;esperimento. Raccogliere embrioni di gestazione appropriato in ghiaccio freddo HBSS integrato con 1% HEPES. <ol><li> Determinare un organo esterno o visibile che dimostreràattività di giornalista e di esaminare gli embrioni utilizzando uno stereo microscopio a fluorescenza. Raccogliere gli embrioni che presentano attività di giornalista in ghiaccio freddo HBSS integrato con 1% HEPES come questi sono oggetto dell&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Raccogliere le ossa temporali: <ol><li> Lavorare rapidamente, utilizzando una sorgente di luce fredda e una pinza sottile, raccogliere le teste dei cuccioli. Fare attenzione a clip in vertebre cervicali e sotto la mascella per evitare danni alle ossa temporali. </li><li> Aprire con cautela il cranio. Rimuovere il cervello, tagliare la parte anteriore della testa, e trasferire il cranio posteriormente ghiaccio fresco HBSS freddo addizionato con 1% HEPES in un piatto pulito. Sezionare con cautela le a forma di ossa temporali di arachidi avendo cura di mantenere il sistema vestibolare in tatto. </li></ol></li><li> Sezionare la coclea: <ol><li> Trasferire le ossa temporali ad un piatto rivestito nero elastomero siliconico in ghiaccio freddo HBSS integrato con 1% HEPES, pin regione vestibolare dell&#39;osso. Inserire i perni di insetti aun angolo obliquo per stabilizzare l&#39;osso temporale e creare spazio per le pinze. Il fissaggio è un passo cruciale nel processo come se l&#39;osso temporale può muoversi troppo è molto difficile raccogliere una coclea intatta. </li><li> Rimuovere con cautela la cartilagine che circonda la coclea. Inserire una barba della pinza nella cartilagine sul bordo esterno della base della coclea e ritagliare un foro nella cartilagine. </li><li> Agganciare un lembo sul lato, inserire il dente della pinza e separare delicatamente il tetto del condotto dalla cartilagine. Agganciare orizzontalmente nella parte superiore e in diagonale, e sollevare con cautela la parte anteriore della capsula. Inserire un polo della pinza tra la cartilagine rimanente e il condotto e la clip delicatamente l&#39;ultima sezione. La superficie apicale della coclea è ora esposta. </li><li> Partendo dalla base, prendere l&#39;area dove il tetto del condotto incontra l&#39;epitelio cocleare e aprire il condotto cocleare. Rimuovere delicatamente il tetto, tagliose necessario fino a quando non viene completamente rimosso. Tagliare porzioni di membrana sinistra sul lato mediale del condotto. Pulire il condotto di tessuto mesenchimale eccesso e staccare il condotto dal sistema vestibolare. </li></ol></li><li> Cultura espianti: <ol><li> Inserire un espianto, luminale superficiale fino, al centro di un vetro rivestito piatto di coltura di fondo del substrato, accuratamente erogare tutto il liquido e lasciate per due minuti. Aggiungere 150 microlitri DMEM integrato, goccia a goccia per l&#39;espianto, facendo attenzione a non disturbarlo. Qualora l&#39;espianto galleggiare liberamente, riposizionare con una pinza, ma fare attenzione che l&#39;espianto si deposita sul fondo del piatto in modo che possa collegare al substrato. </li><li> Porre le capsule fondo di vetro da 12 cm di diametro piatto Petri profondo, con un piattino di acqua sterile per mantenere l&#39;umidità. Mettere culture in un incubatore a 35 ° C durante la notte in modo che l&#39;espianto di allegare al substrato e appiattire. </li></ol></li></ol> 2. live Imaging <ol><li> Selezionare campioni espianto. Utilizzare uno stereo microscopio a fluorescenza per valutare la condizione di ciascuna coclea espiantato. Selezionare espianti solo se il condotto è intatta e attaccata al vetro dalla base all&#39;apice. </li><li> Impostare l&#39;incubatore a 35 ° C con il 5% di CO 2 per coltura di tessuti cocleare. Mettere le culture nel microscopio incubatore: <ol><li> Aspirare delicatamente il DMEM integrato e sostituirlo con almeno 500 ml di media fresco. Per l&#39;imaging fino a 6 giorni, 1-1,5 ml è meglio. Nei casi in cui espianti sono vagamente collegati, pipettare un anello di media di tutto il bordo del piatto. Questo liquido in più farà una miniatura &#39;camera umidificata&#39; senza disturbare l&#39;espianto mentre si continua ad attribuire alla matrice. <ol><li> In alternativa, l&#39;uso incernierato piatto copre per aprire i coperchi mentre il piatto rimane nel suo montaggio al microscopio se i reagenti devono essere scambiati durante gli intervalli tra le raccolte di immagini. Coperture piatto incernierati permettono i coperchi di essereaperto senza disturbare i campioni o di estrarre le stoviglie dalle loro impostazioni. Questo mantiene la loro esatta posizione per le successive acquisizioni di immagini. </li></ol></li><li> Inserire i piatti di vetro di fondo contenenti campioni adeguati nel supporto piatto del campione. Il microscopio in questo esempio ha una piattaforma rotante che contiene otto piatti 35 millimetri campione. </li><li> Sotto la cappa a flusso laminare sostituire i coperchi di plastica con coperchio di vetro e inserire i piatti nel supporto piatto del campione. Posizionare il supporto piatto del campione all&#39;interno dell&#39;incubatrice facendo attenzione a non spostare il espianti dal fondo del piatto o disturbare media. </li></ol></li><li> Impostare la routine di imaging: <ol><li> Accendere il microscopio, lampada UV e la fotocamera e aprire il software di imaging. </li><li> Individuare i campioni, scegliere un area di esposizione, piano di messa a fuoco e regolare i tempi di esposizione per ogni piatto in sequenza. Scegliere il piano di messa a fuoco dipende non solo la vista del espianto al momento della partenza, ma alavendo presente come il tessuto si muoverà e per quanto tempo il decorso verrà eseguito. </li><li> Impostare una pila Z centraggio intorno al piano focale selezionato nel canale di fluorescenza. Impostare la frequenza e la lunghezza del campionamento per l&#39;esperimento. La frequenza di campionamento è limitata dal tempo necessario per raccogliere le immagini, quindi questo dovrebbe essere determinato dopo aver selezionato campi di vista e impostando una pila Z. In questo caso il campionamento ha luogo ogni 30 minuti in cinque giorni. La durata dell&#39;esperimento può essere fino a 14 giorni. </li></ol></li><li> Genera un film: <ol><li> Alla fine del periodo di time lapse aprire i file di immagine. Viene utilizzato in questo caso il software Metamorph che si apre punti di raccolta sequenziali. Fotogramma per fotogramma scegliere il miglior piano focale per mostrare la popolazione di cellule. </li><li> Convertire le immagini in un file .avi, o esportarli come un montaggio per generare un insieme di immagini che possono essere aperti e analizzati nel software di elaborazione delle immagini o convertiti in forma multiplats utilizzando il software di elaborazione video. </li></ol></li></ol>

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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diversi punti tecnici da considerare quando le culture sono stabiliti e nella creazione del microscopio time-lapse in modo per l&#39;imaging a lungo termine. Usiamo matrice di membrana basale come substrato per la coltura di espianti cocleari, ma il supporto deve essere adattato al tipo di cellula. Ad esempio, per colture neuronali di immagine, può essere meglio per fornire un rivestimento fibronectina. Temperatura di incubazione e la composizione del gas dovrebbero essere scelti in...

La coclea dei mammiferi è un organo complesso altamente ordinato. Nel topo, tra l&#39;emergere dell&#39;orecchio interno primitiva vescicola otica del giorno E11 e il completamento del programma di sviluppo nelle fasi postnatali precoci, più ondate di segnalazione cellulare e cambiamenti coordinati nell&#39;espressione genica hanno luogo. Esecuzione dalla base all&#39;apice del condotto cocleare è il suono di rilevamento epitelio sensoriale, o l&#39;organo del Corti. Sviluppo dell&#39;organo del Corti è squisitamente controllato in modo tale che entro la fine dello sviluppo, che sarà composto da una sola fila di cellule ciliate interne, tre file di cellule ciliate esterne intervallate da cinque file di cellule di supporto (due file di celle pilastro, tre file di celle Deiters &#39;) 1. Deviazione da questo preciso ordine si traduce in perdita di udito, heighlighting l&#39;importanza di studye Ofthe genesi e patterning del epithemlium sensoriale 2. In coltura in vitro del mouse Coch embrionalelea è uno strumento essenziale per lo studio dei meccanismi di sviluppo dell&#39;organo del Corti. Questa tecnica è stata fondata nel 1974 e nel corso degli ultimi 40 anni, è stato utilizzato per chiarire molti dei meccanismi attraverso i quali è specificato l&#39;epitelio sensoriale e l&#39;organo del Corti stabilito 3. La coclea è un organo complesso con processi di sviluppo dinamici; una manipolazione può richiedere fino a sette giorni per manifestare 1. Ad esempio, quando si aggiunge inibitori GSK 3β ad una cultura espianto cocleare a E13, il periodo di incubazione ottimale per osservare un effetto robusto del composto è di sei giorni 4. Immagini dal vivo della coclea in via di sviluppo permette di indagine in cambiamenti nella morfologia dell&#39;organo del Corti, cambiamenti di espressione genica, il monitoraggio di migrazione, proliferazione o morenti cellule, e permette l&#39;osservazione in tempo reale dei risultati di agenti farmaceutici e la rottura di segnalazione percorsi. Fino ad ora, vivere l&#39;imaging della cocleaè stata principalmente effettuata mediante microscopia confocale a immagini piccole aree dell&#39;organo del Corti in periodi di tempo brevi 5-8, ma questa tecnica ha dei limiti dovuti alla redditività espianto. Nelle immagini degli effetti delle manipolazioni a lungo termine sui processi evolutivi lenti, l&#39;ambiente di imaging è cruciale. Tipicamente un sistema di imaging vivo confocale utilizza una scatola di plastica umidificata che siede sul microscopio. Calore e umidità possono sfuggire attraverso le fessure nella scatola incubazione dove incontra il tavolo microscopio, attraverso le finestre di accesso, attraverso le aperture a battente e attraverso le aperture intorno varie parti del Microscopio quali l&#39;obiettivo o della sorgente luminosa. Questo non è ottimale per mantenere espianti sani per più di due o tre giorni. Definiamo &#39;microscopio incubatore&#39; come un microscopio invertito sigillato all&#39;interno di un livello di CO 2 incubatore, piuttosto che un incubatore costruito intorno al microscopio. Un microscopio incubatore extende la durata dell&#39;esperimento tale che piuttosto che l&#39;imaging in due o tre giorni, i campioni possono essere esposte per due settimane. Un microscopio incubatore fornisce un ottimo ambiente per la crescita cellulare e la differenziazione, con il minimo disturbo per espiantare le culture e le condizioni standard controllato. Negli studi che si svolgono su più giorni è comune ricorrere a campioni di imaging quotidianamente rimuovendoli dal termostato e li trasporta ad un microscopio a fluorescenza invertito. Anche se questo approccio può funzionare, di estrarre le stoviglie dal termostato infligge stress sul tessuto in via di sviluppo sensibile. Variazioni acidità del mezzo di coltura e le fluttuazioni di temperatura dovuto alla rimozione dal termostato può provocare lo sviluppo ottimale e tessuto sano. Imaging stessa regione nello stesso piano focale e nello stesso orientamento in ogni punto temporale è estremamente impegnativo. Utilizzando un sistema automatizzato all&#39;interno di un incubatore, è possibile mantenere in buona salutetessuti, per raccogliere le immagini a più punti di tempo e di garantire che la stessa area viene catturato in ogni fotogramma. Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi incubatori tessuto microscopio integrati, questi sono stati utili non solo nella pratica clinica 9 ma anche in cellule staminali e cancro ricerche 10,11. Qui vi presentiamo un protocollo per il lungo termine l&#39;imaging dal vivo di espianti embrionali del mouse cocleari. Usiamo un sistema di microscopia automatizzata all&#39;interno di un incubatore CO 2 standard che ha la capacità di catturare immagini di più campioni in momenti insieme. Il sistema è costituito da un microscopio invertito impostato all&#39;interno di un incubatore. I campioni sono collocati in una pedana rotante che permette l&#39;imaging di campioni multipli ad ogni tempo. Illuminazione, l&#39;acquisizione di immagini e la rotazione della pedana sono controllati da un sistema automatico gestito tramite software Metamorph. Impostando una routine di imaging con il software operativo possiamo impostare un esperimento di correre per un massimo di two settimane con minimo intervento umano. In questo esempio si usa sia in campo chiaro e fluorescenza a mostrare una crescita su larga scala e riarrangiamento della coclea, e, in particolare, la regione prosensory. In questo esperimento, coclee verrà sezionato da Sox2 EGFP topi reporter del giorno embrionale E13. Sarà stabilita culture in vitro e poi ripreso nel corso di cinque giorni.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle media</td><td>Gibco</td><td>12430</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>Basement membrane extract&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers.&lt;br/&gt; http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>5630080</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>100 x N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution</td><td>Gibco</td><td>14170161</td><td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use.&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&amp;amp;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11254-20</td><td>Size number 5&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&amp;amp;CategoryId=29</td></tr><tr><td>Curette&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10080-05</td><td>size 1 mm&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&amp;amp;CategoryId=118</td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-35</td><td>Must be stainless Steel&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td></tr><tr><td>50 mm plastic dishes</td><td>Corning/Falcon</td><td>351006</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>charcoal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05105-250G</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>184 silicone elastomer</td><td>Dow/Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td><td>Dishes are home made several weeks in advance.&amp;nbsp; Silicone elastomer can be from any supplier.&lt;a href=&quot;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&quot;&gt;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&amp;nbsp; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL.&lt;br/&gt; http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&amp;amp;cPath= 1_4_15&amp;amp;products_id=2</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>495101-9804-000</td><td>&amp;nbsp;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td></tr><tr><td>Cold Light Source</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-182</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td></tr><tr><td>Fluorescent Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Leica microsystems</td><td>Contact Leica microsystems</td><td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td></tr><tr><td>Incubator Microscope +imaging software</td><td>Olympus</td><td>Contact Olympus</td><td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software.&lt;br/&gt; http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&amp;amp;c=0</td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Thermo Scientific</td><td>51029701</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3310</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td></tr><tr><td>Laminar Flow hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026651</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td></tr></tbody></table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

Qui vi presentiamo un metodo a lungo termine time-lapse imaging dal vivo espianti del mouse cocleari embrionali. Il programma di sviluppo responsabile della costruzione altamente ordinata, complessa struttura dei proventi coclea di mammifero per una decina di giorni. Al fine di studiare i cambiamenti nell&#39;espressione genica in questo periodo e la loro risposta alla farmaceutica o la manipolazione genetica, l&#39;imaging a lungo termine è necessario. In precedenza, l&#39;imaging in tempo reale è tipicamente stata limitata dalla redditività del tessuto espiantato in una camera umidificata cima a un microscopio standard. Difficoltà nel mantenere condizioni ottimali per la crescita della cultura in materia di umidità e temperatura ha posto limiti alla lunghezza di esperimenti di imaging. Un microscopio integrato in una coltura di tessuti incubatore modificato fornisce un ambiente ideale per l&#39;imaging a lungo termine-live. In questo metodo si dimostra come stabilire embrionali di topo espianti cocleari e come utilizzare un microscopio incubatore per condurre lasso di tempo Imaging utilizzando sia in campo chiaro e microscopia a fluorescenza per esaminare il comportamento di una tipica giornata embrionale (E) 13 espianto cocleare e Sox2, un marker delle cellule prosensory della coclea, su 5 giorni.

Qui vi mostriamo un montaggio (Figura 1) e un film (Figura 2), a dimostrazione di come un tipico espianto cocleare organotipica crescerà se placcato su E13.5. Un Sox2 topo reporter è stato utilizzato per visualizzare la regione prosensory. Il film illustra che la coclea subisce crescita e la convergenza ed estensione, le cellule nella zona laterale del dominio Sox2 verde non sembrano dividere il tessuto circostante si espande. Questa è una caratteristica dell&#39;or...

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Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Immagini dal vivo della coclea embrionale dei mammiferi è impegnativo, perché i processi di sviluppo a portata di mano operano su un gradiente temporale nell&#39;arco di dieci giorni. Qui vi presentiamo un metodo per la coltura e quindi l&#39;imaging embrionale dei tessuti espianto cocleare preso da un topo reporter fluorescente in cinque giorni.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K Views.  Sunnybrook Research Institute.  Immagini dal vivo della coclea embrionale dei mammiferi è impegnativo, perché i processi di sviluppo a portata di mano operano su un gradiente temporale nell'arco di dieci giorni. Qui vi presentiamo un metodo per la coltura e quindi l'imaging embrionale dei tessuti espianto cocleare preso da un topo reporter fluorescente in cinque giorni. 

Video: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

A lungo termine intravitale immunofluorescenza Imaging di tessuto componenti della matrice con Epifluorescenza e due fotoni Microscopia

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Bioingegneria

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET remain unknown. Electrophysiological studies of hair cells revealed that the MET channel has a large conductance and is permeable to relatively large fluorescent cationic molecules, including some styryl dyes and Texas Red-labeled aminoglycoside antibiotics. In this protocol, we describe a method to visualize and evaluate the uptake of fluorescent dextrans in hair cells of the organ of Corti explants that can be used to assay for functional MET channels. We found that 3 kDa Texas Red-labeled dextran specifically labels functional auditory hair cells after 1&#8211;2 h incubation. In particular, 3 kDa dextran labels the two shorter stereocilia rows and accumulates in the cell body in a diffuse pattern when functional MET channels are present. An additional vesicle-like pattern of labeling was observed in the cell body of hair cells and surrounding supporting cells. Our data suggest that 3 kDa Texas-Red dextran can be used to visualize and study two pathways for cellular dye uptake; a hair cell-specific entry route through functional MET channels and endocytosis, a pattern also available to larger dextran.

Here, we present a method for visualizing the uptake of 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditory hair cells with functional mechanotransduction channels. In addition, dextrans of 3&#8211;10 kDa can be used to study endocytosis in hair and supporting cells of the organ of Corti.

Etichette e acquisizioni Dextran nelle cellule dei capelli Murine Cochlear dal vivo e funzionali

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un<em&gt; In vitro</em&gt; Strumento di screening nella ricerca acustica

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Medicina

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Neuroscienze

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia that are arranged in rows of increasing height. When stereocilia are deflected, they tug on tiny (~5 nm in diameter) extracellular tip links interconnecting stereocilia, which convey forces to the mechanosensitive transduction channels. Although mechanotransduction has been studied in live hair cells for decades, the functionally important ultrastructural details of the mechanotransduction machinery at the tips of stereocilia (such as tip link dynamics or transduction-dependent stereocilia remodeling) can still be studied only in dead cells with electron microscopy. Theoretically, scanning probe techniques, such as atomic force microscopy, have enough resolution to visualize the surface of stereocilia. However, independent of imaging mode, even the slightest contact of the atomic force microscopy probe with the stereocilia bundle usually damages the bundle. Here we present a detailed protocol for the hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) imaging of live rodent auditory hair cells. This non-contact scanning probe technique allows time lapse imaging of the surface of live cells with a complex topography, like hair cells, with single nanometers resolution and without making physical contact with the sample. The HPICM uses an electrical current passing through the glass nanopipette to detect the cell surface in close vicinity to the pipette, while a 3D-positioning piezoelectric system scans the surface and generates its image. With HPICM, we were able to image stereocilia bundles and the links interconnecting stereocilia in live auditory hair cells for several hours without noticeable damage. We anticipate that the use of HPICM will allow direct exploration of ultrastructural changes in the stereocilia of live hair cells for better understanding of their function.

Here we present a protocol for the Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), a non-contact scanning probe technique that allows nanoscale imaging of stereocilia bundles in live auditory hair cells.

Stereocilia Bundle Imaging con risoluzione su scala nanometrica in cellule ciliate uditive di mammiferi vivi

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

Imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso l'organo di Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

Imaging della coclea invecchiata con microscopia a fluorescenza a foglio di luce

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

Espianti cocleari neonatali interi come modello in vitro

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...