Bu çalışma, Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) ve Hallym Üniversitesi Araştırma Fonu'ndan (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) araştırma hibeleri ile desteklenmiştir.

ICR farelerini içeren tüm araştırma protokolleri Wonju Tıp Fakültesi'ndeki Yonsei Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Deneyler Dünya Tabipler Birliği Etik Kuralları'na göre gerçekleştirildi. Bu protokolde, hamile ICR fareleri yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile 12/12 saat açık / karanlık bir döngüde tutuldu.
1. Koklea diseksiyonu
<ol><li>Ultraviyole ışığını ~30 dakika açarak laminer akış dokusu kültür davlumbazını sterilize edin ve kullanmadan önce tüm yüzeyleri% 70 etanol ile püskürtün. Yüzeylerin kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Diseksiyon aletlerini 10 dakika boyunca% 70 etanol içine yerleştirin ve kullanmadan önce kurutun.</li>
	<li>Doğum sonrası 3-4 günlük farelerin kafasını kesmek için bir çalışma bıçağı kullanın (Şekil 2A).</li>
	<li>Kafatasını laminer akış başlığına bir stereomikroskopun altına yerleştirin ve dokuyu% 70 etanol içine batırın.</li>
	<li>Etanol çıkarmak için dokuyu doku diseksiyon çözeltisine (1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi, 1 mM HEPES) hızlı bir şekilde batırın.</li>
	<li>Kafatasının orta çizgisini cerrahi bir bıçakla kesin (Şekil 2B,C).</li>
	<li>Cildi ön olarak aşağı çekerek ve kulağın dış işitsel kanalını keserek kafatasını ortaya çıkarın (Şekil 2D).</li>
	<li>Ön kısımdan kafatasının arka kısmına göz çizgisi boyunca kesin (Şekil 2E).</li>
	<li>Kafatasını açın ve künt forps ile beyin, beyincik ve beyin sapı çıkarın (Şekil 2F,G).</li>
	<li>Mikro kümes uçlarını kullanarak kokleayı temporal kemikten ayırın (Şekil 2H).</li>
	<li>Kokleayı doku diseksiyon çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Koklear otik kapsülün tümünü dikkatlice parçalara ayırın, sadece iç koklear yumuşak doku bırakın(Şekil 2I,J).</li>
	<li>Kokleanın modiolularını başka bir çift asa ile kümes ve koklear kanal ile tutun ve iki dokuyu yavaşça ayırın (Şekil 2K).</li>
	<li>Stria vascularis ve tectorial membranları nazikçe soyup çıkararak çıkarın (Şekil 2L,M).</li>
	<li>Sterilize edilmiş bir plastik kapak kapağını yeni doku diseksiyon çözeltisine yerleştirin ve ardından Basilar zarının aşağı doğru yüzleştiğinden emin olarak Corti organını 9 mm çapında bir kapak kapağına yerleştirin (Şekil 2N-P).</li>
	<li>Reissner'ın zarını ve kalan modiolus dokusunups ile kapak kılıfına bastırarak dokuyu hareketsiz hale verin (Şekil 2N-P).</li>
	<li>Gömülü doku ile kapak sapını 35 mm çapındaki bir konfokal kabın ortasına aktarın.</li>
	<li>Cam klonlama silindirini, koklear eksplant ile çanağın ortasına yerleştirin ve silindirin içine 100 μL eksizyon kültürü ortamı (DMEM / F12,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 N2 takviyesi, ampisilin (10 μg / mL))10 ekleyin (Şekil 2Q).</li>
	<li>Plaka 5 ×10 3 hücre fare kemiği iliği türevi yeşil floresan protein (GFP)-etiketli MSC'ler 2 mL kültür ortamında (%45 DMEM + %45 DMEM/F12, %10 FBS, %1 N2 takviyesi, 10 μg/mL ampisilin) cam silindirin dışında (Şekil 2R).<ol>
<li>MSC'ler % 80-90 birleştiğinde, tripin-etilenediamin tetraasetik asit ile ayırarak bunları geçiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konfokal kabı dikkatlice nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın ve % 5 CO2 atmosferinde 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Silindirin içindeki ve dışındaki tüm ortamı aspire edin ve ardından cam silindiri konfokal tabaktan çıkarın.</li>
	<li>Konfokal yemeğe 2 mL taze kültür ortamı ekleyin ve doku kültürü çanağini analize hazır olana kadar nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2.jpg"> Şekil 2. Bir fare kokleasının diseksiyonu ve Corti ve MSC organlarının kokültürü. (A) Farenin kafasının kesilmesi, (B) ve (C) başın orta çizgi sagittal diseksiyonu, (D) ve (E) beynin koronal diseksiyonu, (F) ve (G) beyin ve temporal kemiğin çıkarılması, (H) koklea, (I) kemik koklear duvarının çıkarılması, (J) koklear kanalın modiolustan ayrılması, (L) stria vascularis (SV) ve spiral ligamentin (SL) Corti'nin organından ayrılması, (M) tectorial membranının çıkarılması, (N-P) kokleanın plastik bir kapak kaymasına sabitlenmesi, (Q) konfokal çanaktaki kapak ve cam silindirin yeri, (R) MSC'lerin aşılanması. Beyaz ölçek çubuğu (A-E) = 1 cm; turuncu (F, G, P) ve sarı ölçek çubuğu (H,I) = 1 mm; yeşil ölçek çubuğu (J-O) = 0,5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Zaman atlamalı görüntüleme
<ol><li>Burada sunulan deneyler için, sahne üstü inkübatör sistemine sahip bir konfokal mikroskopi sistemi kullanın.</li>
	<li>Konfokal mikroskobu, floresan ışığı ve bilgisayarı açın.</li>
	<li>Konfokal mikroskop sahnesine yerleştirilen sahne üstü inkübatörün koşullarını 37 °C ve %5 CO2 atmosfere ayarlayın.</li>
	<li>Numune kabını bulaşık sabitleme kabına yerleştirin, bulaşık sabitleme kapağıyla örtün ve odayı üst ısıtıcı kapağıyla kapatın.</li>
	<li>Corti ve MSC'lerin organını görüş alanında yerelleştirmek için yakınlaştırmayı ve odağı ayarlayın.</li>
	<li>Görüntü işleme yazılımını açın. Bul seçeneğinin altında, 20x Plan-Apochromat hedefi (sayısal diyafram 0,8) ve 0,5x kırpma alanıseçin.</li>
	<li>Edinmealtında, akıllı kuruluma tıklayın ve EGFP'yi seçin.</li>
	<li>Satın Almaaltındaki kanal sekmesini açın ve lazer gücünü% 0.2, iğne deliğini 44 μm, ana kazancı 750 Vve dijital kazancı 1.0olarak ayarlayın.</li>
	<li>Görüntüleme kurulumualtında ESID'ye tıklayın ve ESID kazancını 4'e ve dijital kazancı 7,5olarak ayarlayın.</li>
	<li>210 fayans üretmek için Fayans ve kazık tıklayın.</li>
	<li>Odak stratejisini açın ve odak modunuseçin.</li>
	<li>Zaman serisialtında, süreyi 24 saat ve aralığı 10 dk olarak ayarlayın.</li>
	<li>Edinmealtında, çerçeve boyutunu 512 x 512 piksel, tarama hızını 8, yönü çift yönlü, ortalamayı 4xve piksel başına bitleri 16olarak ayarlayın.</li>
	<li>Denemeye başlamak için denemeyi başlat'a tıklayın.</li>
</ol>3. Görüntü dosyası değişikliği
<ol><li>İşlemealtında, dikişetıklayın ve minimum kaplamayı% 5'e ve maksimum kaymayı% 10'aayarlayın.</li>
	<li>Film dışa aktarma, sıkıştırılmamışolarak ayarlayın ve hızı 7,5olarak ayarlayın.</li>
</ol>4. İmmünasyon
<ol><li>Ortamı dikkatlice emiş edin ve numuneyi fosfat tamponlu salin (PBS) ile 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.</li>
	<li>Örneği PBS'de %4 formalin ile 15 dakika sabitlayın ve numuneyi PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Numuneyi PBS'de %0,1 Triton X-100'de 10 dakika permeabilize edin ve 5 dakika pbs ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>250 μL phalloidin-iFluor 647 reaktifi (PBS'de 1:1000 seyreltme) ekleyin ve numuneyi çalkalayıcıda oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Numuneyi PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Kapak kapağını cam slayda aktarın ve 2 damla montaj çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Slayda hafifçe bir kapak kılıfı yerleştirin.</li>
	<li>Kapak kapağını berrak oje ile kapatın ve hücreler gözlemlenene kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Slaydı, phalloidin için 650/665 nm ve EGFP için Ex/Em=488/507 nm'de uygun bir filtreye sahip bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+hearing+loss+prevention.">Global hearing loss prevention.</a> Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+migration+and+tissue+repair.">Mesenchymal stem cell migration and tissue repair.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Uder, C., Br&#252;ckner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MSC+from+selected+species:+Features+and+applications.">Mammalian MSC from selected species: Features and applications.</a> Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).</li><li>Rojewski, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+a+standardized+manufacturing+protocol+for+mesenchymal+stromal+cells:+A+systematic+comparison+of+validation+and+manufacturing+data.">Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data.</a> Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).</li><li>Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell+homing:+Mechanisms+and+strategies+for+improvement.">Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement.</a> iScience. 15, 421-438 (2019).</li><li>Ahn, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+enhance+efficacy+of+SPION-labeled+stem+cell+homing+by+magnetic+attraction:+a+systemic+review+with+meta-analysis.">Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).</li><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li><li>Sykova, E., Jendelova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+stem+cells+in+brain+and+spinal+cord+injury.">In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury.</a> Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).</li><li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration,+invasion,+and+adhesion+assays:+From+cell+imaging+to+data+analysis.">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).</li><li>Rask-Andersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cochlea:+anatomical+characteristics+and+their+relevance+for+cochlear+implantation.">Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation.</a> The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).</li><li>Kamiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transplantation+accelerates+hearing+recovery+through+the+repair+of+injured+cochlear+fibrocytes.">Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes.</a> The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).</li><li>Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+safety+and+efficacy+of+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+sensorineural+hearing+loss+patients.">Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients.</a> Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).</li><li>Vanden Berg-Foels, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tissue+regeneration:+chemoattractants+for+endogenous+stem+cell+recruitment.">In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).</li><li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants.">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).</li><li>Oshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+hair+cell-like+cells+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 141 (4), 704-716 (2010).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Hasarlı hücrelerin yenilenmesini teşvik etmek için MSC'lerin hasarlı bölgelere nakli kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve terapötik etki açıktır. MSC'lerin transplantasyonu ve daha sonra farklılaşması, 3-nitropropionik asit13tarafından indüklenen işitme kaybı olan sıçanlarda işitmeyi geri getirdiği bildirilmiştir. Lee ve arkadaşları insanlara trans-venöz olarak MSC'ler uygulamış olsalar da, işitmede önemli bir iyileşme sağlayamadılar14. Y...

İşitme kaybı doğuştan ortaya çıkabilir veya yaşlanma, ilaçlar ve gürültü de dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden giderek kaynaklanabilir. İşitme kaybı genellikle tedavi etmek zordur, çünkü işitmeden sorumlu saç hücreleri hasar gördükten sonra bozulmuş işlevi geri yüklemek çok zordur1. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, dünya nüfusunun %6,1'ini oluşturan dünya genelinde 461 milyon kişinin işitme kaybı olduğu tahmin edilmektedir. İşitme kaybı olanların %93'ü yetişkin, %7'si çocuk.
İşitme kaybını tedavi etmek için bir dizi yaklaşım denenmiştir; özellikle MSC'leri kullanan bir rejenerasyon yaklaşımı umut verici bir tedavi olarak ortaya çıkmıştır. Doku hasar gördüğünde, MSC'ler doğal olarak dolaşım sistemine salınır ve rejenerasyon2'yidestekleyen bir mikroçevre oluşturmak için çeşitli moleküller salgıladıkları yaralanma bölgesine göç eder. Bu nedenle, hasarlı hücre fonksiyonu 3,4,5'inrestorasyonunu geliştirmek için organları hedeflemek için dışarıdan implante edilmiş MSC'lerin göçü ve daha sonra güçlü bağışıklıkdüzenlemesine, anjiogenez ve anti-apoptoza neden olan moleküllerin salgılanması yoluyla hasarlı dokuları tedavi etmek için bir yöntem geliştirmek önemlidir.
MSC'lerin hasarlı dokulara göç ettiği takip süreci aşılması gereken en önemli engel olabilir. MSC'ler, bağlama/yuvarlama, aktivasyon, tutuklama, transmidigrasyon/diapedez ve geçiş 6,7,8sıralı adımlarına sahip sistemik bir homingmekanizmasınasahiptir. Şu anda, bu adımları iyileştirmenin yollarını belirleme çabaları devam ediyor. Genetik modifikasyon, hücre yüzey mühendisliği, in vitro astarlama ve manyetik rehberlik gibi çeşitli stratejiler test edilmiştir6,7. Buna ek olarak, MSC'leri hasarlı koklea bölgesine yerle bir ederek işitsel saç hücrelerinin korunmasını ve yenilenmesini teşvik etmek için çeşitli girişimlerde bulunulmuştır. Bununla birlikte, VIVO'daki MSC'leri izlemek zaman alıcı ve emek yoğundur ve son derece özel beceriler gerektirir9.
Bu sorunu çözmek için, hücrelerin birkaç saat boyunca geçişini fotoğraflayan zaman atlamalı konfokal mikroskopi yoluyla kokleadaki MSC'lerin homingini gözlemlemek için bir yöntem geliştirilmiştir (Şekil 1). 20. yüzyılın başlarında geliştirilmiştir ve son zamanlarda belirli hücrelerin göçlerini incelemek için güçlü bir araçhaline gelmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig01.jpg" style="font-size: 14px;"> Şekil 1: Grafiksel özet. (A) Corti'nin parçalanmış organı, uzunlayıp kullanılarak plastik bir kapakçık üzerine yapıştıktan sonra, kapak kapağı 35 mm cam tabanlı konfokal mikroskobik bir kabın üzerine yerleştirilir ve (B) cam silindir yerleştirilir. (C) Cam silindirin içini orta ile doldurduktan sonra, (D) orta ile GFP etiketli MSC'ler silindirin dışına dikkatlice eklenir. (E) Bir gecede inkübasyondan sonra, (F) cam silindir çıkarılır ve konfokal mikroskopla görüntüler alınır. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; MSC'ler = mezenkimal kök hücreler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>10X PBS Buffer</td><td>GenDEPOT</td><td>P2100-104</td><td></td></tr><tr><td>4% Formalin</td><td>T&amp;amp;I</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>sigma&amp;nbsp;</td><td>A5354-10ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>sigma&amp;nbsp;</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>confocal dish</td><td>SPL</td><td>200350</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>coverslip</td><td>SPL</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsheild with DAPI</td><td>sigma&amp;nbsp;</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Dumont</td><td>0508-L5-P0</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647 Reagent</td><td>abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>Stage Top Incubator</td><td>TOKAI HIT</td><td>WELSX</td><td></td></tr><tr><td>Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP</td><td>cyagen</td><td>MUBMX-01101</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>sigma&amp;nbsp;</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro time-lapse live-cell imaging to explore cell migration toward the organ of corti

Mezenkimal kök hücrelerin (MSC' ler) hücre yenilenmesi ve tedavisi üzerindeki etkilerini incelemek için bu yöntem koklear epitel ile birlikte kültürden sonra MSC göç ve morfolojik değişiklikleri izler. Corti'nin organı, reissner'ın diseksiyon sırasında üretilen zarının bir kısmına basılarak plastik bir kapak kapağı üzerinde hareketsiz hale getirildi. Cam silindirle sınırlı olan MSC'ler, silindir çıkarıldığında koklear epitellere doğru göç etti. Baskın lokalizasyonları, Corti organının modiolusunda, sinir liflerine benzer bir yönde hizalanmış olarak gözlendi. Bununla birlikte, bazı MSC'ler limbus bölgesinde lokalize edildi ve yatay olarak uzatılmış bir şekil gösterdi. Ayrıca saç hücresi bölgesine göç arttırıldı ve kanamycin tedavisinden sonra MSC'lerin morfolojisi çeşitli formlara dönüştü. Sonuç olarak, bu çalışmanın sonuçları, KOKLEAR epitel ile MSC'lerin kokültürünün hücre nakli yoluyla terapötiklerin gelişimi ve çeşitli durumları ve faktörleri inceleyebilen hücre yenilenmesi çalışmaları için yararlı olacağını göstermektedir.

MSC'lerin üç boyutlu modda in vitro geçişi, iki boyutlu (2D) mod11'degeçişi gözlemlemek için bir Transwell sistemi veya geleneksel yara iyileştirme yöntemi ile değerlendirilmiştir. Corti'nin organı Boettcher hücreleri, Claudius hücreleri, Deiters hücreleri, sütun hücreleri, Hensen hücreleri, dış saç hücreleri, iç saç hücreleri, sinir lifleri, basilar membran ve retiküler lamina12gibi çeşitli hücrelerden oluşan ...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti at JoVE.com

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

Bu çalışmada, Corti organını içeren koklear epitel ile eks vivo inkübasyon ile hasarlı dokuya doğru hareket eden hücreleri gözlemlemek için konfokal mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz.

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

in-vitro-time-lapse-live-cell-imaging-to-explore-cell-migration

Research

JoVE Journal

Medicine

3.7K Görüntüleme.  Yonsei University Wonju College of Medicine. Bu çalışmada, Corti organını içeren koklear epitel ile eks vivo inkübasyon ile hasarlı dokuya doğru hareket eden hücreleri gözlemlemek için konfokal mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz.

Video: In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Biyomühendislik

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Nörobilim

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Gelişim Biyolojisi

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler