Ehi, ragazzi, mi chiamo Wang Yangdong, e sono del laboratorio di bioingegetamica molecolare dr.Kiryl Piatkevich della Westlake University. Oggi vi mostrerò la procedura per l'imaging delle attività neuronali dell'ippocampo nei topi, in vivo. Accendere la saldatrice e riscaldarla fino alla temperatura richiesta.
Regolare la posizione della cannula di imaging e della cannula di iniezione usando le mani di aiuto come mostrato nella figura. Utilizzando la siringa con l'ago, applicare una piccola quantità di flusso appropriato sui punti di connessione tra l'imaging e l'iniezione di cannula per cinque secondi, quindi rimuovere la goccia. Montare lo stagno di saldatura e applicarlo al punto di connessione trattato con il flusso.
Evitare l'eccesso di stagno di saldatura in quanto richiederà un inutile cranial più grande da fare durante l'intervento chirurgico. Aspetta che la lattina di saldatura si raffredda. Di solito, ci vogliono diversi secondi.
Verificare che la cannula di iniezione non sia bloccata inserendo la cannula fittizia da entrambe le direzioni. Applicare l'adesivo ottico di polimerizzazione UV sul lato inferiore della cannula di imaging utilizzando uno stuzzicadenti o un ago per siringhe calibro 26. Utilizzare una pinzetta fine per posizionare con cura un vetro di copertura della dimensione corrispondente alla cannula di imaging.
Polimerizzare l'adesivo per almeno un'ora con l'illuminazione UV da una lampada UV portatile standard. Anestetizzare il mouse con isoflurane secondo la procedura approvata dalla IACUC. Posizionare il mouse in un telaio stereotassico sopra un tappetino riscaldante chirurgico.
Fissare la testa con le barre auricolari. Spingere leggermente la testa in tutte le direzioni per assicurarsi che la testa sia fissata saldamente. Applicare unguento per gli occhi per evitare che gli occhi dell'animale si asciughino durante l'intervento chirurgico.
Utilizzare un trimmer o una crema depilatoria per rimuovere la pelliccia dalla parte posteriore del collo fino agli occhi. Sterilizzare il sito chirurgico con betadina seguita dal 70% di etanolo tre volte prima di fare un'incisione. Rimuovere la pelle sopra la parte superiore del cranio, iniziando con il taglio orizzontale intorno alla base della testa, seguito da due tagli nella direzione rostrale, quasi raggiungendo le palpebre.
Poi due tagli obliqui che convergono sulla linea mediana. Con due tamponi di cotone sterili, ritrarre il tessuto di collegamento, così come la muscolatura della parte posteriore del collo ai bordi del cranio. Applicare una goccia di soluzione di lidocaina sulla superficie del periostio per due minuti per evitare dolori eccessivi.
Raschiare delicatamente l'intera area esposta del cranio con un bisturi per creare una superficie asciutta e ruvida. Posizionare la punta dell'ago sulla Lambda per vedere se la coordinata AP è zero per confermare che la posizione della testa è verticale, così come se la coordinata ML è zero, per confermare che la testa è posizionata orizzontalmente. In caso meno, regolare le manopole corrispondenti sulla stazione stereotassica fino a quando le coordinate AP e ML sono entrambe entro 0,1 millimetri.
Spostare la punta dell'ago per trovare i punti corrispondenti per la craniotomia e contrassegnare le loro posizioni sul cranio, usando un pennarello fine. Disegnare un cerchio basato su quattro punti contrassegnati, così come il contorno dell'area della cannula di iniezione sul lato della cannula del cerchio. Utilizzare un trapano pneumatico alla velocità di 10.000 colpi al minuto per praticare delicatamente lungo il contorno contrassegnato sul cranio.
Perforare il cranio fino a quando non viene lasciato uno strato molto sottile di osso, che di solito inizia a muoversi sotto un tocco delicato al centro. Applicare una goccia di PBS sterile al centro della craniotomia. Sollevare il lembo osseo dal cranio con pini con punta molto sottile o due aghi calibro 26 che si avvicinano dai lati opposti.
Applicare PBS seguito da aspirazioni delicate, attraverso un ago smussato calibro 26 più volte per pulire la superficie della dura. Applicare un'aspirazione delicata per abiurare la corteccia e il Corpus Calloso sopra l'ippocampo. Cortex è spesso più gialla del Corpus Calloso.
E il Corpus Calloso è solitamente più largo dell'ippocampo. Inoltre, il Corpus Calloso è davvero facile da distinguere per le fibre neuronali che vanno in direzione verticale e orizzontale quando osservate dall'alto. Il sanguinamento a questo punto influenzerà la visibilità del tessuto cerebrale nella craniotomia.
Applicare PBS, seguito da una leggera aspirazione, mentre si aspira la corteccia per sbarazzarsi del sangue, Corpus Callosum può essere riconosciuto dalla direzione delle fibre bianche come schematicamente mostrato nel diagramma. Rimuovere le fibre di Corpus Callosum strato per strato applicando un'aspirazione delicata con un movimento circolare. Pbs viene costantemente applicato per sbarazzarsi del sangue che si accumula sopra il tessuto cerebrale esposto.
Inserire delicatamente l'impianto nella craniotomia. Premere saldamente sopra l'impianto con l'ago a forma di L per posizionare la finestra ottica dell'impianto il più vicino possibile alla superficie esposta dell'ippocampo. Applicare ripetutamente PBS sulla cicatrice intorno all'impianto, seguito dall'aspirazione per rimuovere il sangue il più possibile durante l'inserimento dell'impianto.
Applicare un sottile strato di tenuta rapida tra l'impianto e il cranio per evitare che il cemento dentale penei sotto il cranio. Una volta che la tenuta rapida è polimeri, applicare il super legame uniformemente sulla superficie del cranio, sulla superficie della tenuta rapida e sulla superficie dell'impianto. Una volta che il super legame è guarito, applicare la resina di base della protesi sopra il super legame, così come la pelle intorno all'incisione effettuata all'inizio dell'intervento chirurgico.
Dopo aver polimerizzata la resina di base della protesi, posizionare la piastra della testa sulla resina intorno all'impianto e farlo concentrare con la cannula di imaging. Applicare più resina di base della protesi intorno e sopra la piastra della testa per fissarne la posizione. Lascialo curare per diversi minuti.
Evitare di costruire uno spesso strato di cemento intorno alla cannula per garantire un migliore accesso alla finestra di imaging è l'obiettivo. Diluire la resina di base della protesi per diminuirne la viscosità, permettendogli così di riempire le cavità difficili da raggiungere con un applicatore. Posizionare delicatamente un nastro di gomma isolato sopra la finestra per proteggere la finestra da possibili contaminazioni da bande animali.
Aggiungere la soluzione fast green dye stock alla soluzione antivirus diluirla al timone desiderato nel rapporto da uno a nove, in un tubo PCR. Prelevare 600 nano litri della soluzione virale, rimuovere la cannula fittizia e inserire la cannula interna collegarla alla siringa di iniezione nella cannula guida. Infondere il virus alla velocità di 15 nano litri al minuto, per 10 minuti in totale.
Mantenere la cannula interna collegata per 10 minuti per consentire al virus di diffondersi sotto la finestra. Rimuovere delicatamente la cannula interna dalla cannula guida e riacquisirla con la cannula fittizia. Indurre il mouse con il 4% di isoflurane per alcuni minuti.
Fissare la piastra della testa alla forcella della testa, quindi fissare la forcella della testa al tapis roulant. Usa un obiettivo a basso ingrandimento per trovare il meglio per filtrare la vista per l'imaging funzionale. Quindi, passare a una lente obiettiva più alta per registrare le attività neuronali a risoluzione a singola cellula.
Per l'imaging del calcio, il fluorescente verde era eccitato da un LED da 470 nanometri disponibile in commercio utilizzando un senso di filtro GFP standard. Per ottenere tracce fluorescenti, le regioni di interesse, corrispondenti alla massa cellulare neuronale, sono state segmentate manualmente e analizzate dal software ImageJ. Per l'imaging di tensione utilizzando un obiettivo 40 X sono state eseguite registrazioni di tensione ottica nel canale del vicino infrarosso a velocità di acquisizione di 830 Hertz.
La registrazione spontanea dell'attività neurale è durata continuamente fino a 25.000 fotogrammi. Qui descriviamo un metodo per l'imaging a lungo termine dell'ippocampo come regione A1 nel comportarsi con i topi. Il metodo si basa sull'impianto cronico.
Ora la finestra di imaging su misura, che consente anche la somministrazione mirata di virus o farmaci direttamente ai neuroni di interesse. Crediamo che il protocollo descritto faciliterà gli studi che mirano a indagare l'attività neuronale con alta risoluzione temporale spaziale nell'ippocampo di comportarsi con topi utilizzando semplici e convenienti set-up di imaging a 1 fotone.
