Ciao a tutti. Mi chiamo Nicolas Wein. Sono uno dei principali investigatori del Nationwide Children's Hospital di Columbus, Ohio.
E oggi vi mostreremo un video su come prendere una biopsia cutanea e convertirla in mioblasti e miotubi. Questo è uno strumento molto utile per studiare il disturbo neuromuscolare. Inoltre, è una tecnologia molto più veloce rispetto all'IPSC perché stiamo usando due diversi tipi di virus per combattere direttamente questo tipo di cellule.
Questo video dimostra il protocollo per stabilire colture di fibroblasti derivati dalla pelle umana, la conversione in mioblasti e quindi miotubi differenziati. Una biopsia cutanea viene trasferita alla coltura cellulare per derivare fibroblasti dermici. I lentivirus che trasportano geni hTERT e MYOD vengono utilizzati per trasdurre questi fibroblasti.
Dopo l'aggiunta del mezzo di crescita del mioblasto integrato con doxiciclina, viene espresso il gene MYOD, inducendo la conversione dei fibroblasti in mioblasti. Successivamente, il mezzo viene passato a un mezzo di differenziazione, integrato anche con doxiciclina. Quindi i mioblasti si fondono tra loro, formando miotubi multinucleati.
Aspirare il supporto dal tubo e risciacquare la biopsia con 10 millilitri, uno x PBS a temperatura ambiente, tre volte. Dopo il terzo lavaggio, lasciare il PBS nel tubo. Versare il PBS e la biopsia cutanea su un piatto quadrato di 10 centimetri.
Usando bisturi sterili, tagliare la biopsia in pezzi il più piccoli possibile. Utilizzando una pipetta, trasferire un singolo pezzo di pelle su un piatto quadrato sterile di 10 centimetri. Aspirare l'eccesso di PBS da ogni pezzo.
Fare attenzione a non aspirare il pezzo stesso. Coprire parzialmente i piatti con il coperchio e lasciare asciugare i pezzi di biopsia della pelle per cinque o 20 minuti. Non lasciare asciugare i pezzi troppo a lungo.
Una volta che i pezzi sono asciutti, inclinare il piatto con un angolo di 45 gradi e aggiungere lentamente 12 millilitri di mezzo fibroblasto all'angolo del piatto. Abbassare il piatto, distribuendo attentamente i supporti in modo che i pezzi non siano sollevati dal supporto. Posizionare i piatti nell'incubatrice.
Sostituire il supporto in cinque o sette giorni e una volta alla settimana dopo. Seme fibroblasti primari al 30% di confluenza e due pozzi di una piastra di 12 pozza, circa 20.000 cellule per pozzo, al fine di avere circa il 50% di confluenza il giorno successivo. Per la trasduzione lentivirale, aggiungere da due a 5 miliardi di genomi virali di hTERP Puromicina Lentivirus e 400 microlitri di mezzo fibroblasto.
Aggiungere il mix di lentivirus a un bene. Al secondo pozzo, aggiungere solo 400 microlitri di mezzo fibroblasto. Il giorno seguente, aggiungere un millilitro di media.
Uno o due giorni dopo, trasferire le cellule in una piastra di sei pozzi e farle crescere fino a raggiungere il 60-70% di confluenza. Integrare il mezzo fibroblasto con un microgrammo per millilitro di Puromicina e aggiungere due millilitri ad ogni pozzo. Tenere le celle sotto selezione fino a quando tutte le celle del pozzo di controllo sono morte per almeno 12 giorni, cambiando il supporto ogni due o tre giorni.
Grafico seed H che esprime fibroblasti al 30% di confluenza in tre pozzi della piastra dei 12 pozzi per avere circa il 50% di confluenza il giorno successivo. Per la trasduzione lentivirale, mescolare da due a cinque miliardi di genomi virali di MYOD Hygromycin B lentivirus e 400 microlitri di mezzo fibroblasto e aggiungere a due pozzi. Aggiungere un millilitro di mezzo il giorno successivo.
Uno o due giorni dopo trasferiscono le cellule in una piastra di sei pozzi e crescono fino al 60-70% confluenti. Integrare i mezzi di crescita con 400 microgrammi per millilitro di Hygromicina B.Aggiungere due millilitri a ciascun pozzo. Tenere le celle sotto selezione fino a quando tutte le celle nei pozzi di controllo non sono morte, in genere impiegando almeno 12 giorni, cambiando il supporto ogni due o tre giorni.
Per l'induzione dei mioblasti, far crescere i fibroblasti fino a quando non sono confluenti al 70%. Aggiungere otto microgrammi per millilitro di doxiciclina al mezzo di crescita del mioblasto. Utilizzare sempre aliquote fresche di doxiciclina e media.
Il mezzo dovrebbe essere preparato proprio prima che qualsiasi cambiamento dei media. Inoltre, la doxiciclina non deve essere rifozenata. Aspirare il mezzo fibroblasto e sciacquare le cellule con PBS.
Aggiungere 10 millilitri di mezzi di mioblasto integrati. Due o tre giorni dopo, le cellule sono dal 90 al 95% confluenti e la loro morfologia sarà cambiata. Aspirare il supporto di crescita del mioblasto e sciacquare la superficie cellulare con PBS.
Aggiungere 10 millilitri di mezzi di differenziazione che sono stati integrati con otto microgrammi per millilitro di doxiciclina fresca. Continuare a cambiare i media ogni due o tre giorni fino a formare miotubi. Da sette a 10 giorni dopo l'inizio della differenziazione del miotubo, le cellule dovrebbero essere completamente differenziate, ma questo varia da una linea cellulare all'altra.
I primi fibroblasti possono emergere cinque giorni dopo che i pezzi della pelle sono stati in coltura. Nella foto B, i fibroblasti sono confluenti e pronti per essere trasferiti a mastri quadrati di 75 centimetri per un'ulteriore proliferazione. È importante congelare diverse fiale di fibroblasti a basso numero di passaggi quando le cellule primarie entrano nella senescenza replicativa.
Una volta stabilite le linee cellulari FM per la conversione dei fibroblasti in miotubi, i fibroblasti devono proliferare fino al 70% confluente come mostrato nell'immagine A.È importante non superare l'80% di confluenza, poiché un'alta densità può compromettere la differenziazione. Dopo l'aggiunta di doxiciclina al mezzo, entro due o quattro giorni le cellule diventano mioblasti, caratterizzati da una morfologia allungata e orientamento parallelo come si vede nella foto B.I miotubi differenziati sono mostrati nella figura C.Il tempo per la fusione e la differenziazione dei miotubi può variare da sette a 21 giorni a seconda del genotipo cellulare. Le cellule devono essere raccolte o fissate prima di staccarsi.
L'inizio del distacco può essere osservato dal colore e dalla luminosità dei bordi del miotubo, come sottolineato dalle frecce in questa immagine. Per immunofluorescenza, l'espressione di proteine specifiche del muscolo maturo conferma la riuscita conversione dei fibroblasti in miotubi. In queste immagini vengono visualizzate tre celle diverse.
Il grado di differenziazione varia da cellula a cellula, e può essere o meno effettuata dalla mutazione primaria in quanto è il caso delle cellule nelle figure B e C.Un'ulteriore convalida del modello è stata confermata da RNAseq. Come mostrato in questa trama ci sono più di 12.000 geni espressi in modo differenziato rilevati nei miotubi FM rispetto a quello del muscolo scheletrico. La correlazione significativa tra entrambi i trascrizioni supporta che le cellule FM hanno un profilo di espressione specifico del muscolo che dimostra che sono un surrogato utile e affidabile per le linee cellulari derivate dai muscoli.
Per illustrare l'utilità di questo modello in vitro, abbiamo usato una delle duplicazioni esoniche più comuni nel gene DMD. La duplicazione di Exon due porta all'interruzione del frame di lettura DMD e il suo salto può portare al ripristino di quel frame di lettura o all'utilizzo del sito di ingresso ribosoma interno. Questa terapia è già stata convalidata con studi in vivo Figura A, abbiamo dimostrato la prova del concetto con l'analisi RTPCR di questa particolare linea cellulare mutata, con e senza trattamento saltando l'esone.
La macchia occidentale nella figura B dimostra che la proteina distrofina funzionale è espressa nelle cellule trattate. Quando si confronta l'efficienza di questa terapia con modelli in vivo, i risultati supportano l'affidabilità della tecnica di differenziazione cellulare e ne supportano l'uso per testare varie terapie geniche specifiche per mutazioni. Prima degli studi clinici necessari per testare l'efficacia del supporto terapeutico ufficiale sui disturbi neuromuscolari, a seconda della capacità dei modelli animali e cellulari.
Lo sviluppo di modelli animali, sebbene sia più facile al giorno d'oggi, non è un'opzione fattibile per ogni mutazione specifica. La generazione di mioblasti attraverso cellule IPS derivate da fibroblasti dermici è un'alternativa, ma è una tecnica che richiede molto tempo. Pertanto, questa procedura è una semplice alternativa alla generazione IPS che consente la conversione diretta dei fibroblasti in mioblasti.
Facilita l'accesso ai modelli cellulari umani evitando l'applicazione più invasiva delle biopsie muscolari In conclusione, questa conversione diretta dei fibroblasti in mioblasti è un potente strumento per testare terapie per disturbi neuro muscolari in un contesto specifico di limitazione.
