Il seguente protocollo fornisce istruzioni per generare cellule staminali pluripotenti autologhe indotte dall'uomo attraverso la riprogrammazione rapida ed efficiente dei fibroblasti dermici umani isolati da una biopsia del punzone cutaneo. Le procedure possono essere eseguite da ricercatori con poca o nessuna esperienza nella riprogrammazione cellulare e con una corretta regolazione, consente il prodotto di cellule staminali pluripotenti indotte senza xeno. Le cellule IPS autologhe potrebbero essere utilizzate per applicazioni di medicina rigenerativa e per modellare malattie come disturbi genetici o cancro per indagare sui meccanismi molecolari sottostanti e sviluppare terapie più specifiche.
Il carico di lavoro è elevato. È estremamente utile studiare il protocollo prima di pianificare attentamente l'esperimento, compresi i passaggi durante i quali devono essere preparati reagenti e materiali. La dimostrazione visiva della procedura aiuta le ricerche con poca o nessuna esperienza a eseguire l'isolamento cellulare e la riprogrammazione, evitando errori comuni legati a possibili contaminazioni microbiche e RNA.
Sotto un cappuccio sterile, lavare il campione appena ottenuto di pelle umana dall'addome in un piatto da 100 millimetri con soluzione HPSS. Rimuovere capelli e grasso usando forcelle e forbici fini e sezionarlo con un bisturi per ottenere frammenti delle dimensioni di due millimetri per un millimetro, evitando cicatrici, aree sporche o bruciate del tessuto. Mettere quattro piccoli frammenti in ogni piatto da 35 millimetri, coprire con un vetro di copertura sterile e aggiungere 1,5 millimetri di I-DMEM.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per circa 15 giorni o fino a quando le cellule raggiungono l'85% di confluenza. Cambia il mezzo di coltura ogni tre giorni e controlla la crescita delle cellule utilizzando quotidianamente un microscopio a contrasto di fase invertito. Ora, sollevare gli occhiali di copertura con forcep fini, posizionarli a testa in giù in un piatto da 100 millimetri e lavare con 1X PBS sterile.
Rimuovere i frammenti dei campioni e scartarli. Lavare le piastre con PBS sterile 1X. Rimuovere il 1X PBS e aggiungere tre millimetri di Trypsin-EDTA ai bicchieri di copertura posizionati nel piatto da 100 millimetri e aggiungere un millimetro di Trypsin-EDTA anche ai piatti da 35 millimetri.
Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Quindi, bloccare la tripsidenza aggiungendo cinque millimetri di TSS al piatto da 100 millimetri e due millimetri di TSS a ogni piatto da 35 millimetri. Raccogliere la sospensione in tubi sterili da 15 millimetri, centrifugare a 400 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in 12 millimetri di I-DMEM. Dividere la sospensione cellulare in aliquote di tre millimetri e trasferirle ciascuna in una piastra di 60 millimetri. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.
Cambia il mezzo ogni giorno. Mantenere le cellule in coltura fino a raggiungere una confluenza del 75%Dopodi tempo, ripetere la tripinazione tre volte per ottenere celle che ne passino quattro. Quindi, sincronizzare le cellule sostituendo l'I-DMEM con S-DMEM e incubare per 48 ore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.
Durante la sincronizzazione cellulare, preparare il mezzo di espansione dei fibroblasti e il cocktail totale di riprogrammazione dell'RNA non modificato per la programmazione senza fibroblasti. Per semplificare la preparazione dei nove tubi di aliquote di RNA non modificate che vengono poi suddivise in 36, seguiva uno schema che abbiamo attaccato alla parete del cofano. Rivestire una piastra da 24 porri trasferendo 100 microlitri di matrice di membrana basale scongelati sul ghiaccio su ciascun pozzo per coprire uniformemente il fondo.
Incubare per almeno un'ora a 37 gradi Celsius prima di seminare le cellule. Aspirare il mezzo da piastre con cellule in coltura e lavare rapidamente in 1X PBS. Ripetere la tripsicinazione per ottenere celle che passaggino cinque.
Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in un volume appropriato di mezzo di espansione dei fibroblasti. Preparare e pulire l'emocitometro con il 70% di alcol. Quindi, preparare una soluzione mescolando delicatamente 10 microlitri di tripano blu e 10 microlitri di sospensione cellulare in un tubo da 1,5 millilitri e incubare per uno o due minuti a temperatura ambiente.
Pipettare 10 microlitri della soluzione nell'emocitometro e posizionarlo sullo stadio di un microscopio a contrasto di fase invertito per contare. Le cellule non vitali sono blu mentre le cellule vitali non sono contaminate. Contare le cellule in almeno due quadrati della camera dell'emocitometro.
Eseguire una diluizione per ottenere una densità di 2,5 volte 10 alla quarta cella per 500 microlitri di mezzo di espansione dei fibroblasti e rimostrare il pellet cellulare. Pipetta 500 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo della piastra da 24 pozzi. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Al mattino, rimuovere il vecchio mezzo da ogni pozzo e sostituirlo con 500 microlitri di mezzo di coltura senza fattori senza xeno pre-zarmed. Incubare a 37% gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per almeno sei ore. Scongelare cinque aliquote da 15,4 microliter del cocktail di riprogrammazione totale di nmRNA a temperatura ambiente, quindi metterli nel ghiaccio.
Aggiungere 234,6 microlitri di mezzo siero ridotto a ciascuna aliquota, pipettare delicatamente da tre a cinque volte ed etichettarli ciascuno come tubo A.Etichettare cinque tubi sterili senza RNasi da 0,5 millilitri come tubo B e mescolare sei microlitri di reagente di trasfezione dell'RNA sintetico di piccole interferenze con 244 microlitri di mezzo siero ridotto. Quindi, utilizzare pipette per aggiungere il contenuto di ogni tubo B a un tubo A per quanto riguarda la caduta. Mescolare toccando il fondo del tubo.
Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Successivamente, per aggiungere 125 microlitri di soluzione complessa di trasfezione di nmRNA da ciascuna delle cinque aliquote ad ogni pozzo, inclinare la piastra e la pipetta cadere saggiamente nel mezzo. Mescolare il contenuto nei 20 pozzi dondolando delicatamente.
Utilizzare i restanti quattro pozzi come riferimento. Incubare la piastra per 15 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno dopo, aspira il mezzo.
Sotto il cappuccio sterile, ripetere la procedura di trasfezione, come il primo giorno, ogni giorno per altri tre giorni. Il quinto giorno, aspirare il mezzo e scambiare con il mezzo di coltura XF /FF fresco prerifavorato sotto un cappuccio sterile. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Monitorare quotidianamente la coltura cellulare con un microscopio a contrasto di fase, fino ad osservare la formazione di colonie IPSC. Lo scopo di questo protocollo era quello di riprogrammare i fibroblasti dermici isolati dalla pelle addominale utilizzando un metodo di riprogrammazione non integrato. I fibroblasti umani svergozzano da campioni di pelle addominale entro una settimana dalla coltura e hanno raggiunto l'85% di confluenza entro due settimane.
Le cellule erano caratterizzate da una crescita adesiva su piatti di coltura plastica e la loro morfologia variava da allungata e a forma di mandrino a appiattita e a forma di stella. La morfologia, la disposizione e la coltura dei fibroblasti cambiarono radicalmente dopo la semina su BMM, quando acquisirono una morfologia allungata e disposte a formare sottili strutture ramificate. Le piccole colonie erano già visibili in cultura al primo giorno dalla prima trasfezione e le loro dimensioni crescevano progressivamente nel tempo, mentre il loro numero aumentava fino al settimo giorno e poi rimaneva stabile tra il settimo giorno e il giorno 14, probabilmente a causa della fusione di colonie più piccole per formare colonie più grandi.
Poiché la procedura di riprogrammazione è stata eseguita utilizzando mezzi senza antibiotici, nel caso in cui non fossero garantite condizioni sterili, la contaminazione microbica è diventata un problema importante. Il tasso di proliferazione e la densità di placcatura hanno un impatto sull'efficienza di riprogrammazione, quindi è importante pianificare il passaging cellulare e definire la densità di placcatura sulla base del tasso di proliferazione cellulare. Sostituendo i reagenti di origine animale con reagenti appropriati senza xeno, questo protocollo consente la riprogrammazione dei fibroblasti umani adulti in cellule IPS in un ambiente di coltura completo privo di xeno che non erano il loro uso clinico.
Le cellule umane sono una potenziale fonte di infezione da agenti patogeni ematici, quindi i dispositivi di protezione individuale dovrebbero essere indossati durante tutta la procedura.
