Questo protocollo consente l'identificazione e l'isolamento delle cellule staminali tumorali in modo robusto utilizzando saggi funzionali e caratterizzazione fenotipico. L'isolamento delle cellule staminali tumorali da un campione tumorale potrebbe essere una piattaforma per guidare l'applicazione clinica di terapie specifiche ai singoli tumori, predicendo la resistenza e conseguente reoccurrence. Per preparare colture di sospensione non aderenti, rivestire prima i contenitori di coltura cellulare con 50 microlitri per centimetro squadrati di 15 milligrammi per millilitro di poliHEMA e posizionare i contenitori in un forno di essiccazione Celsius di 37 gradi per almeno due giorni.
Quando i contenitori sono completamente asciutti, lavare in coltura di linee tumorali confluenti dall'80 al 90% con PBS e staccare le cellule con uno o due millilitri di tripside EDTA. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, arrestare la reazione con due o quattro millilitri di mezzo di coltura cellulare fresco e lavare le cellule dissociate per centrifugazione. Sospendere il pellet in un mezzo di coltura fresco per il conteggio e diluire le cellule in un mezzo di coltivazione a sfera fresco contenente il due per cento di cellulosa metile a una concentrazione di piatti da 500 a 2000 celle per centimetro al quadrato per coltura.
Per garantire la monoconalità della sfera, semere ogni linea cellulare a bassa densità in un ambiente privo di ancoraggio. Quindi seminare le cellule sulle piastre rivestite in poliHEMA per un'incubazione di cinque giorni a 37 gradi Celsius e al cinque per cento di anidride carbonica, aggiungendo dieci nanogrammi per millilitro del fattore di crescita epidermico e dieci nanogrammi per millilitro del fattore di crescita dei fibroblasti di base al mezzo di coltura cellulare ogni due giorni. Da tre a dodici giorni dopo la placcatura, le colonie cellulari tridimensionali a forma di sfera dovrebbero essere osservate mediante microscopia ottica.
Per ottenere popolazioni derivate aderenti, trasferire le sfere in un nuovo piatto di coltura nelle condizioni di coltura appropriate per la linea cellulare del cancro originale. Dopo uno o due giorni di coltura, si dovrebbe osservare un monostrato cellulare che cresce intorno alle sfere aderenti con una morfologia simile a quella della linea cellulare di origine. Per determinare la capacità di formazione della sfera della linea di interesse delle cellule tumorali, dopo il completamento del protocollo di formazione della sfera, raccogliere le sfere per centrifugazione.
Rimescolare delicatamente il pellet di sfera in mezzo fresco e utilizzare un emocitometro per contare il numero di sfere con un diametro superiore a 40 micrometri. Quindi calcolare il rapporto percentuale della sfera ottenuta rispetto al numero di celle inizialmente placcate. Per determinare la capacità di autori rinnovimento della linea cellulare di interesse, raccogliere le sfere per centrifugazione e rimorsi delicatamente il pellet di sfera nell'EDTA di tripina per un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, aggiungere enzima e mezzo di attivazione al tubo e pipettare la soluzione per ottenere una sospensione a cella singola. Utilizzando un emocitometro e il metodo di esclusione blu del tripano, contare le cellule vitali nella sospensione e placcare le cellule in piastre rivestite in poliHEMA per un saggio di formazione di sfere come appena dimostrato. Dopo otto giorni, usa un emocitometro per contare il numero di sfere con un diametro superiore a 40 micrometri e calcolare il rapporto percentuale di sfere ottenute rispetto al numero di cellule inizialmente placcate.
Per valutare l'area occupata dalle sfere, posizionare il piatto di coltura sul palco di un microscopio invertito dotato di un modulo di acquisizione di immagini e selezionare un ingrandimento da 100X a 400X. Ottenere immagini di almeno dieci campi casuali per condizione e utilizzare un programma software di analisi delle immagini appropriato per disegnare regioni di interesse intorno alle sfere. Quindi misurare l'area di ogni regione di interesse in pixel e calcolare l'area di proiezione della sfera come area media dei pixel misurati.
La caratterizzazione funzionale della capacità di formazione della sfera, dell'autorinnozione e dell'area di proiezione delle cellule staminali tumorali consente un confronto della loro discendenza lontana e del tessuto di origine. Il protocollo di formazione della sfera consente di ottenere colonie sferiche in sospensione da diverse linee cellulari endometriali e tumorali del seno o dopo una delicata digestione enzimatica dei tessuti da campioni tumorali umani. Sia le sfere di cancro all'endometrio che al seno danno origine a un monostrato cellulare con morfologie simili alla loro linea cellulare di origine da uno a due giorni dopo la placcatura.
In questi esperimenti rappresentativi, le cellule MCF-7 positive del recettore ormonale hanno dimostrato una maggiore capacità di formazione della sfera, capacità di autorennozione e area di proiezione rispetto alle cellule tumorali del seno HCC1806 triplo-negative. Oltre all'arricchimento delle cellule staminali tumorali attraverso il protocollo di formazione della sfera, raccomandiamo l'ulteriore valutazione della loro staminalità utilizzando metodi complementari come la citometria del flusso. In questa analisi rappresentativa delle sfere ottenute dalle linee cellulari endometriali, quattro popolazioni di cellule che esprimono marcatori di cellule staminali tumorali sono state identificate in ogni linea cellulare dalla citometria a flusso.
La valutazione delle sfere tumorali con altre tecniche di biologia molecolare può essere confermata della staminali e della plasticità delle cellule staminali tumorali e ha facilitato lo sviluppo di terapie mirate. L'analisi western della macchia dopo la raccolta delicata della sfera ha anche rivelato un fenotipo di cellule staminali tumorali per le sfere generate in vitro. Questo protocollo di isolamento contribuisce alla nostra comprensione del significato delle cellule staminali tumorali che si traduce clinicamente nella comprensione di ricadute, metastasi e resistenza al trattamento.
