Questo metodo utilizza i vari modi per affrontare le sfide di espressione delle proteine virali ricombinanti usando una proteina virale P'come chaperone per un'altra proteina virale N'per ottenere proteine N senza RNA. La proteina RSV N priva di RNA si ottiene prima di assemblare l'RNA specifico del virus in nucleocapsid in vitro. Il metodo può anche essere utilizzato con altri virus dell'RNA a senso negativo non segmentati.
Il metodo di clonazione indipendente dalla legatura è una tecnica rapida per acquisire costrutti di co-espressione. Perché o elettiva il microscopio elettronico a macchia è un metodo rapido per controllare l'assemblaggio di grandi dimensioni in celle grezze. Vogliamo darti due consigli.
Innanzitutto, ottenere risultati elevati e solidi per ogni passaggio prima di passare al passaggio successivo. In secondo luogo, impostare programmi adeguati per la cromatografia e praticare il prelievo di griglie con forcep. Per la costruzione bi-cistronica della coesiezione N e P, far crescere quattro colture da un litro di cellule di deformazione E coli BL21DE3 in mezzo LB a 37 gradi Celsius.
Quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,6, abbassare la temperatura a 16 gradi Celsius. Dopo un'ora, indurre l'espressione proteica per trattamento con IPTG 0,5 millimolare durante la notte. La mattina seguente, raccogliere le cellule per centrifugazione e rimescolare i pellet in 200 millilitri di tampone di lisi.
lizzare le cellule per sonicazione per 15 minuti, con tre secondi di su, tre secondi di disartimento degli impulsi. E raccogliere i lisati per centrifugazione. Caricare il supernatante in una colonna di gravità cobalto di 2,5 per 10 centimetri, con circa 10 millilitri di perline.
Pre-equilibrato con volumi da 5 a 10 colonne di buffer di lysis. E lavare la colonna con cinque volumi di colonna di tampone B e cinque volumi di tampone C.Utilizzare due volumi di tampone D per elutare la proteina dalle perline. Ed equilibrare la colonna Q con cinque volumi millilitri di buffer QA.
Utilizzare una pompa peristaltica per caricare il campione diluito sulla colonna. Sciogliere la colonna Q caricata sulla macchina HPLC, insieme a nuovi buffer QA e QB. Eseguire il lavaggio della pompa per lavare con successo la macchina con uno o due volumi di tamponi QB e QA.
Dopo l'ultimo lavaggio, impostare la portata su un millilitro al minuto e impostare UV1 su 280 nanometri e UV2 su 260 nanometri, utilizzando una piastra di pozzo profonda 96 per raccogliere le frazioni. Quindi utilizzare un'applicazione gradiente graduale da tre a quattro volumi di ogni concentrazione di agente eluizione per eludere le proteine, a partire da una concentrazione di QB dello 0% e aumentando la percentuale del 5% ogni volta. Il complesso proteico N-0 P elude alla concentrazione tampone del 15%QB.
Isolare la proteina mediante filtrazione in gel, in una colonna di purificazione su piccola scala di uno per 30 centimetri, equilibrata con tampone E.Quindi analizzare la proteina contenente frazioni per pagina SDS. Per l'assemblaggio nucleocapsid specifico del virus, mescolare e incubare il complesso N-0 P purificato con oligo di RNA ad un rapporto molecolare 1:1.5 a temperatura ambiente per un'ora. Pre-equilibrare una colonna di filtrazione del gel di purificazione su piccola scala con tampone E.E rimuovere qualsiasi precipitazione per centrifugazione.
Caricare il supernatante nella colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni. E confrontare le immagini cromatografiche di esclusione delle dimensioni della proteina con l'assemblaggio dell'RNA, e solo i campioni di controllo delle proteine, combinando i rapporti di purezza dell'acido nucleico, per identificare quali picchi sono l'N RNA assemblato, N-0 P e l'RNA libero. Per assemblare un complesso di N RNA, raccogliere tutte le frazioni di picco dell'RNA N, eseguire un'estrazione di RNA ed eseguire un gel di urea page per ricontrollare la lunghezza dell'RNA specifico.
Per preparare una griglia di macchie negative per la microscopia elettronica a macchia negativa, utilizzare una piastra termica per riscaldare 5 mL di acqua distillata doppia all'ebollizione e aggiungere 37,5 milligrammi di formato uranile all'acqua per ottenere una soluzione di colorazione in formato 0,75%uranil. Trasferire la soluzione su un becher coperto di foglio di alluminio. E aggiungere quattro microlitri di 10 idrossido di sodio molare.
Dopo 15 minuti di agitazione protetti dalla luce, filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 micron in una provetta. Per rendere idrofile le reti di microscopia elettronica rivestite di carbonio continuo, posizionare le griglie in una camera collegata a un alimentatore e applicare ioni caricati negativamente sulle griglie. Tagliare e piegare una striscia di parafilm da due per due pollici.
Aggiungere due gocce da 40 microliter di acqua distillata a un'estremità del nastro. E due gocce di 40 microliter dello 0,75% di soluzione di colorazione in formato uro-uro all'altra estremità. Aggiungere tre microlitri di campione proteico a ciascuna griglia.
Dopo un minuto, blocca le griglie contro la carta assorbente e imboschi le griglie due volte nelle goccioline d'acqua distillate. E una volta nella prima goccia di soluzione di colorazione. Quindi immergere la griglia nella seconda goccia di soluzione di colorazione per 30 secondi, prima di gonfiare le griglie contro la carta assorbente per rimuovere qualsiasi soluzione di macchia in eccesso e consentire alle griglie di asciugarsi all'aria prima dell'imaging.
Utilizzando questo protocollo, è possibile ottenere un complesso N0 P del virus respiratorio etero dimerico solubile su larga scala. In E coli, l'intera lunghezza delle porzioni N e N-terminale delle proteine P è co-espressa con un tag 10 X His sulla proteina N. Basato sul rapporto di purezza dell'acido nucleico di assorbanza UV, N0 P conteneva sia la lunghezza intera N che N-terminale P, ma non conteneva RNA cellulare.
L'N0 P purificato potrebbe quindi essere stimolato e assemblato in particelle nucleocapsidi come le particelle sulle griglie di microscopia elettronica attraverso l'incubazione con oligo di RNA specifici come dimostrato. Quando si purifica la proteina evitare bolle d'aria durante la purificazione della colonna e diluire il campione con tampone QA per regolare il pH e la concentrazione di sale prima di caricare il campione sulla colonna. Fare attenzione a tenere le griglie di microscopia elettronica sul bordo esterno per evitare di contaminare le griglie.
Questo ci aiuterà a determinare le domande non positive sull'imballaggio del genoma rsv, che si tratti di struttura elicoiale mancina o destra. Seguendo queste procedure e autenticando un modello di RNA per il test di attività della polimerasi RSV può essere eseguito. E questo nucleocapside specifico virale RSV può essere utilizzato per l'analisi crio EM ad alta risoluzione.
