L'uso di virus ricombinanti è una potente tecnologia sia per decifrare i meccanismi di replicazione virale che per fornire piattaforme di sviluppo per i vaccini. Allo stesso modo, la generazione di stock virali di buona qualità è fondamentale per ogni studio virale dalla ricerca più fondamentale agli studi applicati. Il salvataggio di virus ricombinanti, la raccolta ottimale, il congelamento e la titolazione delle scorte di RSV sono metodi critici per tutti gli studi virologici.
Potrebbero essere considerati tradizionali, ma rimangono delicati e richiedono competenze specifiche. Il giorno prima della trasfezione, sospendere le cellule BSR-T7/5 in mezzo completo a 0,5 milioni di cellule per concentrazione di millilitro. Distribuire due millilitri della sospensione cellulare per pozzo in una piastra a sei poggi.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% fino a raggiungere l'80-90% di confluenza il giorno successivo. Per salvare ogni virus, mescolare prima i vettori genetici inversi scongelati in un tubo, quindi procedere alla trasfezione, seguendo il protocollo del produttore del reagente di trasfezione. Aggiungere quindi 250 microlitri del mezzo siero ridotto ai vettori misti.
In un altro tubo, diluire 10 microlitri di questo reagente di trasfezione in 250 microlitri del mezzo siebro ridotto. Vortice delicatamente entrambi i tubi e attendere cinque minuti. Mescolare il contenuto di entrambi i tubi e attendere 20 minuti a temperatura ambiente.
Nel frattempo, sciacquare le cellule BSR-T7/5 con un millilitro del mezzo siero ridotto e distribuire 1,5 millilitri di antibiotici minimi essenziali liberi integrati con siero di vitello fetale al 10% per pozzo. Se necessario, incubare a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica al 5%. Dopo l'incubazione di 20 minuti, aggiungere 500 microlitri del mix di trasfezione in ogni pozzo.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica al 5% per tre giorni. Per monitorare l'efficienza di salvataggio, osservare a fluorescenza GFP sotto un microscopio a fluorescenza invertita con ingrandimento 20X una volta al giorno. Il terzo giorno di trasfezione, graffiare le cellule in ogni pozzo della piastra transfettata BSR-T7/5 a sei pozza.
Trasferire le cellule e il supernatante di ogni pozzo in un tubo sterile a microcentrifugo a due millilitri. Per rilasciare il virus salvato dalle membrane cellulari, vortice ogni tubo vigorosamente per almeno 30 secondi. Per la prima amplificazione dei virus salvati, rimuovere prima il mezzo di coltura dalla piastra HEp-2 seminata il giorno prima, quindi aggiungere rapidamente 500 microlitri per pozzo della sospensione virale fresco passaggio-zero.
Posizionare la piastra HEp-2 a 37 gradi Celsius su un rocker altalenante per un'agitazione morbida per due ore. Per produrre il primo passaggio dei virus salvati, scartare 500 microlitri dell'inoculo e aggiungere due millilitri di MEM con il 2%FCS. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per tre giorni.
Per monitorare l'infezione sotto un microscopio a fluorescenza invertito con ingrandimento 20X, osservare la fluorescenza GFP delle cellule HEp-2 infettate dalla sospensione passage-zero una volta al giorno. Al microscopio a campo luminoso, osservare l'aspetto della piccola sincrezia e del distacco cellulare, che riflette l'effetto citopatico RSV. Per amplificare i virus salvati, prima diluire la sospensione virale del MEM privo di FCS per ottenere una sospensione di tre millilitri a 50.000 PFU per millilitro, quindi rimuovere il mezzo dal pallone HEp-2.
Aggiungere rapidamente la sospensione virale da tre millilitri e incubare il pallone a 37 gradi Celsius su un rocker seghetto per un'agitazione morbida per due ore. Rimuovere e scartare quindi l'inoculo e aggiungere 15 millilitri di MEM con il 2%FCS. Incubare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per due o quattro giorni.
Per stimare il momento giusto per raccogliere i virus, controllare la morfologia cellulare e la fluorescenza GFP sotto un microscopio a fluorescenza invertito con ingrandimento 20X. Si noti che questo è in genere quando il 50%-80% dello strato cellulare HEp-2 viene staccato a causa dell'effetto citopatico RSV che si verifica tra le 48 e le 72 ore dopo l'infezione. Quindi raschiare tutte le cellule usando un raschietto per celle.
Raccogliere entrambe le cellule e il supernatante insieme e trasferirle in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Aggiungere 1/10 del volume della soluzione di conservazione RSV 10X. Vortice vigorosamente i tubi per cinque secondi e centrifuga per cinque minuti a 200 volte g per chiarire la sospensione.
Trasferire il supernatante in un tubo da 50 millilitri. Vortice brevemente e aliquota la sospensione in tubi criogenici etichettati con tag resistenti all'alcol. Immergere il tubo in alcol pre-raffreddato, meno 80 gradi Celsius per almeno un'ora e conservarli a meno 80 gradi Celsius.
Per eseguire un test di titolazione della placca, prima fare 2 volte il mezzo essenziale minimo diluendo il MEM commerciale 10X con acqua sterile e aggiungendo L-glutammina, 1.000 unità per penicillina millilitro e un milligrammo per millilitro streptomicina. Agitare vigorosamente la diluizione e conservarla a quattro gradi Celsius, quindi aggiungere 900 microlitri del MEM senza FCS a sei tubi. Scongelare le aliquote del virus e vortice vigorosamente per cinque secondi.
Per effettuare diluizioni seriali, aggiungere prima 100 microlitri del virus a 900 microlitri del mezzo nel primo tubo. Mettere il tappo sul tubo e mescolarne il contenuto vortice per alcuni secondi, quindi aggiungere 100 microlitri della prima diluizione a 900 microlitri del mezzo nel secondo tubo. Metti il cappuccio sul tubo e sul vortice.
Ripetere questa procedura fino al sesto tubo. Scrivi il nome del virus e le diluizioni complete sulle piastre HEp-2 12-well. Aggiungere un segno per abbinare la piastra e il suo coperchio perché possono essere separati durante la colorazione.
Rimuovere il mezzo dalle piastre e distribuire 400 microlitri di una diluizione per pozzo. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per due ore per l'adsorbimento del virus. Durante l'adsorbimento del virus, preparare la sovrapposizione di cellulosa microcristallina regolando prima il pH del MEM 2X a circa 7,2 con una soluzione sterile di bicarbonato di sodio al 7,5% seguendo l'indicatore di colore.
Per ottenere 100 millilitri della sovrapposizione, aggiungere 10 millilitri di MEM 2X, 10 millilitri di sospensione di cellulosa monocristallina al 2,4% e 80 millilitri del MEM integrati con 2%FCS e mescolare vigorosamente. Alla fine dell'incubazione di due ore, aggiungere da due a tre millilitri della sovrapposizione a ciascun pozzo delle piastre da 12 po 'senza rimuovere l'inoculo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per sei giorni.
Per macchiare le cellule con soluzione di viola cristallo, prima scuotere delicatamente le piastre per togliere la sovrapposizione di cellulosa microcristallina. Rimuovere i supernaganti e lavare le celle due volte con 1X PBS, quindi aggiungere da uno a due millilitri della soluzione viola cristallo e attendere da 10 a 15 minuti. Rimuovere la soluzione, che può essere riutilizzata per la successiva colorazione della piastra.
Infine calcola i formicolio del virus come frazione del numero di placche visibili nei pozzi delle piastre secche e del volume dell'inoculo e della diluizione. L'esecuzione di un saggio di placca sul controllo negativo, trasfetto solo con l'espressione plasmidi di N, P, L e M2-1 non ha rivelato alcuna placca alla diluizione più bassa. I tintori ottenuti dalle cellule trasfette dovrebbero essere superiori a 100 PFU per millilitro se il salvataggio è stato efficiente.
I formtri sono aumentati nel corso dei passaggi fino a raggiungere un milione a 10 milioni di PFU per millilitro al passaggio uno o due. Grazie a questi virus fluorescenti, l'inibizione dell'espressione RSV da parte del siRNA mirata alla proteina N e alla proteina cellulare IMPDH può essere facilmente osservata e misurata. Al contrario, è stato osservato e misurato un forte segnale GFP sulle cellule di controllo trasfette con siRNA non mirato o cellule trasfette con siRNA contro la proteina cellulare GAPDH.
Allo stesso modo questi virus hanno permesso una facile osservazione dell'inibizione della moltiplicazione RSV da parte di un composto farmacologico antivirale. Il monitoraggio della proteina fluorescente M2-1 nelle cellule infettate da HEp-2 ha mostrato gli IB e i granuli associati all'IB come strutture molto dinamiche. Gli IB sono stati osservati come strutture mobili e sferiche in grado di fondersi e formare inclusioni sferiche più grandi.
I granuli associati all'IB subirono continui cicli di assemblaggio-smontaggio con la formazione di piccoli granuli associati all'IB che crescevano, si fondevano in grandi granuli associati all'IB e poi scomparivano. Il protocollo di titolazione della placca di RSV utilizzando la sovrapposizione di cellulosa microcristallina può essere facilmente adattato ad altre cellule e/o altri virus. Richiederà la regolazione della concentrazione della cellulosa microcristallina.
