Questo protocollo consentirà ai ricercatori non solo di semplificare la loro pipeline di analisi, ma consentirà anche loro di estrarre più informazioni dal loro flusso di organoidi, migliorando così la rilevanza traslazionale. Il vantaggio principale di questo protocollo è che combina un flusso di lavoro semplificato con una pipeline di analisi automatizzata e clinicamente rilevante, consentendo così ai ricercatori di ottenere una quantità convincente di informazioni da un singolo schermo organoide. Questa tecnica può essere utilizzata per prevedere la risposta clinica della terapia per i pazienti oncologici da questi screening di farmaci organoidi ex vivo con risultati precoci molto promettenti.
L'obiettivo è rendere agnostica la piattaforma della soluzione software in modo che i ricercatori possano utilizzare uno strumento di imaging di cellule vive a loro disposizione. Inizia dissociando enzimaticamente gli organoidi tumorali derivati dal paziente, o PDTO, nella matrice extracellulare, o ECM, cupole nella micropiastra a sei pozzetti. Per questo, aspirare prima il mezzo e lavare le cupole ECM una volta con PBS.
Quindi, aggiungere due millilitri dell'enzima di dissociazione nel pozzetto. Pipettare il contenuto su e giù 10 volte utilizzando una pipetta da un millilitro per dissociare meccanicamente gli organoidi nelle cupole prima di incubare la piastra per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, pipettare il contenuto su e giù e verificare la corretta dissociazione degli organoidi in singole cellule utilizzando un microscopio.
Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e portare il volume fino a 10 millilitri aggiungendo ADF + Centrifuga il tubo a 450 g per cinque minuti a temperatura ambiente e aspirare il surnatante utilizzando una pipetta Pasteur e una pompa di aspirazione. Risospendere il pellet in 100-200 microlitri di adenocarcinoma duttale pancreatico completo, o PDAC, terreno di coltura organoide a seconda delle dimensioni del pellet prima di contare il numero di cellule utilizzando un metodo di scelta. Per placcare le singole celle nelle cupole ECM, diluire la quantità appropriata di sospensione cellulare aggiungendo la quantità richiesta di ECM scongelata.
Quindi, pipettare fino a 10 goccioline da 20 microlitri per pozzetto in una piastra a sei pozzetti preriscaldata a 37 gradi Celsius. Capovolgere la piastra e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, sovrapporre i pozzetti con il mezzo completo integrato con 10 micromolari Y-27632 e incubare per due o tre giorni in un'incubatrice.
Per raccogliere gli organoidi di due-tre giorni, aspirare prima il terreno e lavare gli organoidi una volta con PBS. Quindi, aggiungere uno o due millilitri di soluzione di raccolta degli organoidi, pre-raffreddata a quattro gradi Celsius, in un pozzetto della piastra a sei pozzetti a seconda del numero di cupole ECM. Incubare il piatto tenuto sul ghiaccio, su una piattaforma vibrante per 10 minuti.
Ora dissociare le cupole ECM pipettando il contenuto nei pozzetti su e giù con una pipetta da un millilitro. Ancora una volta, incubare gli organoidi per 10 minuti sul ghiaccio prima di confermare visivamente la dissociazione delle cupole ECM al microscopio. Raccogliere gli organoidi in un tubo da 15 millilitri, pre-rivestito con 0,1% BSA in PBS, e portare il volume a 10 millilitri aggiungendo ADF + Centrifuga il tubo a 200 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi, aspirare il surnatante e risospendere il pellet a seconda delle sue dimensioni fino a un millilitro di mezzo organoide PDAC completo fino alla concentrazione organoide finale desiderata. Aprire l'applicazione di controllo del robot di pipettaggio, selezionare Protocolli e fare clic su Importa prima di trascinare e rilasciare il file supplementare 6 fornito nel campo designato. Selezionare il protocollo importato.
E in base al layout mostrato nel campo Configurazione del ponte, posiziona tutti gli articoli da laboratorio, inclusi elementi di raffreddamento e oggetti in plastica, nei ponti. Utilizzare lo slot sinistro per il serbatoio da 25 millilitri e l'elemento di raffreddamento. Quindi, fare clic su Esegui protocollo e procedere all'installazione.
Aprire la scheda Labware Setup, fare clic su Run Labware Position Check e seguire le istruzioni per calibrare il robot di pipettaggio sul nuovo hardware. Riempire il serbatoio da 25 millilitri, posto sopra l'elemento di raffreddamento, con la soluzione di semina organoide raffreddata, e fare clic su Start Run per mettere in azione il robot di pipettaggio. Quindi, centrifugare la micropiastra ad una velocità di 100 g per un minuto a quattro gradi Celsius.
Per creare il protocollo di erogazione del farmaco utilizzando il software di controllo digitale del distributore di droga, passare il puntatore del mouse sulla piastra 1 sopra il layout della piastra. Selezionare Modifica attributi piastra e compilare il tipo di piastra come 384 bene, il volume aggiuntivo come 50 microlitri e il limite DMSO come 1%Aggiungi fluidi facendo clic sul pulsante di aggiunta accanto a Fluidi e fare doppio clic sul fluido appena creato per assegnargli un nome. Quindi, selezionare la classe come basata su DMSO o acquosa più Tween 20 e compilare la concentrazione.
Per creare il layout della piastra per la titolazione dei farmaci, selezionare Wells e fare clic su Titolazione. Per il fluido, selezionare il farmaco di interesse, insieme alla concentrazione più alta desiderata e alla concentrazione più bassa. Per le repliche, selezionate almeno due e scegliete il modello di titolazione desiderato.
Per creare il layout della piastra per il controllo positivo, selezionare tre pozzetti, fare clic su Imposta valore e compilare staurosporina a due micromolari da uno stock di 10 millimolari in DMSO per indurre la massima morte cellulare. Per Cytotox Green, selezionare tutti i pozzetti utilizzati, fare clic su Imposta valore e immettere un valore di 60 nanomolari per pozzetto. Per il controllo negativo e la normalizzazione DMSO, selezionare tutti i pozzetti con altri quattro pozzetti per il controllo del veicolo.
Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Normalizzazione prima di assegnare la classe di fluidi normalizzati come basata su DMSO. Quindi, normalizzare al volume più alto della classe per ottenere una concentrazione DMSO uguale in ciascun pozzetto. Successivamente, fai clic sulla freccia sotto Esegui nell'angolo in alto a sinistra e seleziona Simula sempre, seguito da un clic su Simula per identificare eventuali errori e ottenere i volumi di ciascun farmaco da preparare.
Ora deseleziona Simula sempre sotto il pulsante Esegui prima di fare clic su Esegui per avviare il protocollo di erogazione del farmaco e segui le istruzioni. Applicare la membrana sigillante sulla micropiastra per evitare l'evaporazione. Aprire il software di controllo imager a celle vive e selezionare Editor di metodi Nuovo prima di passare a File per importare il file XML del metodo di esempio.
In alternativa, seguire le istruzioni contenute nel manoscritto per creare un nuovo file. Quindi, fare clic su Avvia per avviare la scansione in T0.To unire e comprimere i dati, creare una nuova cartella principale per trasferire tutte le singole cartelle dell'esperimento generate per ogni scansione in ogni punto temporale dal software di controllo imager live-cell e nominare le rispettive cartelle seguendo le istruzioni fornite nel manoscritto. Preparare una mappa delle lastre XLSX nel software di controllo del distributore digitale di farmaci facendo clic con il pulsante destro del mouse sul layout della mappa delle lastre dal protocollo di erogazione del farmaco e copiando tutti i pozzetti per incollare i dati in un file XLSX.
Rimuovere i dati di Cytotox Green e staurosporine, aggiungere una matrice per la linea cellulare e inserire un controllo negativo e un controllo positivo. Aprire lo strumento di compressione dei dati. Fare clic su Cerca, selezionare la cartella principale e fare clic su Comprimi per avviare la compressione dei dati dell'immagine.
Tutti i file di immagine TIFF vengono compressi in un singolo HDF5 per ogni pozzetto in una nuova cartella dataset all'interno della cartella padre. Per analizzare le immagini, vai alla piattaforma web app di analisi delle immagini, accedi e fai clic su Aggiungi nuovo progetto nella scheda Home. Immettere il nome del progetto, premere Continua e selezionare Aggiungi nuovo esperimento prima di caricare la cartella datasets contenente i file HDF5.
Dopo il caricamento, vai alla cartella del progetto e dell'esperimento per fare clic su Carica mappa piastre per funzionalità aggiuntive. Quindi, fare clic sequenzialmente su Esegui analisi, selezionare Analisi multiorganoide, Parametri predefiniti e infine Analizza per avviare l'analisi dell'immagine. Fare clic su Scarica risultati per scaricare le tabelle dei dati grezzi, che contengono le misurazioni per ciascun pozzo e le immagini o i video segmentati prima di confermare l'accuratezza dell'analisi per un'ulteriore elaborazione dei dati.
Per tenere conto delle variazioni nella densità e nelle dimensioni della semina degli organoidi, sono state utilizzate metriche basate sul tasso di crescita per ridurre le variazioni tra le repliche, come indicato dalle barre di errore ridotte. Le immagini per il controllo negativo, il controllo positivo e il PDTO combinato trattato con gemcitabina e paclitaxel hanno mostrato che la terapia ha indotto prevalentemente l'arresto della crescita con una quantità limitata di morte cellulare, corrispondente al valore normalizzato della risposta al farmaco, o NDR, appena sotto lo zero. Utilizzando due linee aggiuntive, PDAC_052 e PDAC_087, è stata osservata una chiara differenza nel tasso di crescita tra le tre linee, supportando l'uso di metriche GR.
Le curve dose-risposta NDR hanno determinato un aumento della gamma dinamica e della separazione tra i tre diversi pazienti, rispetto alle curve GR. La determinazione del NDR nel tempo ha mostrato che PDAC_052 e PDAC_060 avevano una risposta farmacologica citostatica molto simile a una bassa dose di gemcitabina-paclitaxel, mentre una chiara risposta citostatica differenziale rispetto a quella citotossica poteva essere osservata per le dosi medie e alte corrispondenti. Queste risposte farmacologiche erano coerenti con le risposte cliniche osservate nei pazienti.
La dinamica clonale ha rivelato che PDAC_087 avuto i subcloni più resistenti dopo il trattamento, il che è coerente con la natura aggressiva della malattia osservata nel paziente, che, curiosamente, era anche il meno sensibile alla staurosporina di controllo positiva. L'aspetto più importante del protocollo è quello di mantenere tutte le soluzioni contenenti ECM raffreddate durante la semina perché una solidificazione errata dell'ECM può interferire con l'analisi delle immagini a valle. L'automazione del lavoro di laboratorio umido, l'analisi delle immagini e l'elaborazione dei dati a valle possono essere utili per accelerare la ricerca e identificare più facilmente nuove terapie combinate.
