Il protocollo mira a simulare condizioni in vivo di degenerazione del disco intervertebrale per studiarne la fisiopatologia senza la necessità di modelli animali. Rispetto alla coltura cellulare in vitro, la tecnica di coltura dell'organo bioreattore mantiene le cellule nel loro microambiente biologico e biomeccanico nativo oltre alla fornitura di una condizione di coltura controllabile e riproducibile. Iniziare con il risciacquo completo dell'intera coda bovina con acqua del rubinetto per rimuovere sporco e capelli sulla superficie, quindi immergere la coda in soluzione di betadina all'1% per 10 minuti per disinfettare la superficie.
Utilizzare un bisturi numero 20 per rimuovere il tessuto molle dalla colonna vertebrale caudale per facilitare l'identificazione dei dischi intervertebrali o degli IVD. Rimuovere i processi spinosi e trasversali delle vertebre con una pinze per la rimozione ossea. Tagliare trasversalmente con pinze ossee attraverso il centro di ogni corpo vertebrale per ottenere singoli segmenti di movimento, quindi mettere i segmenti di movimento raccolti in una piastra di Petri con una garza bagnata nella soluzione di Ringer.
Individuare l'IVD nelle vertebre spostando delicatamente i segmenti di movimento, quindi identificare la posizione della piastra di crescita toccando e trovando il lato convesso della piastra finale ossea. Raffreddare la lama della sega a nastro con la soluzione di Ringer e utilizzarla per effettuare due tagli paralleli nella piastra di crescita degli IVD, uno su ciascun lato. Trasferire gli IVD in una piastra di Petri pulita con garza pulita bagnata con la soluzione di Ringer.
Raschiare il corpo vertebrale e la piastra di crescita usando la lama bisturi, lasciando intatta la piastra finale. Posizionare le due superfici piatte e parallele per la procedura di carico e trasferire gli IVD raschiati su una piastra di Petri fresca con garza bagnata con la soluzione di Ringer. Misurare l'altezza e il diametro del disco con una pinza, quindi pulire i coaguli di sangue nell'osso delle vertebre con la soluzione di Ringer utilizzando un sistema di lavanda a getto.
Disinfettare gli IPID in PBS e al 10% di streptomicina penicillina con tremanti per 15 minuti. Risciacquare gli antibiotici ad alta concentrazione con PBS e 1%penicillina streptomicina. Trasferire dischi in camere IVD contenenti cinque millilitri di mezzo di coltura IVD e posizionarli nel sistema bioreattore con un incubatore a 37 gradi Celsius con umidità dell'85% e 5% di anidride carbonica.
Coltura dei dischi per quattro giorni all'interno di un sistema bioreattore mantenendo condizioni di carico diverse a seconda dei gruppi sperimentali. Nel gruppo di controllo fisiologico, coltura gli IVD con mezzo di glucosio elevato utilizzando un protocollo di carico da 0,02 a 0,2 megapascal e 0,2 hertz per due ore al giorno. Nel gruppo patologico, coltura gli IVD con mezzo a basso contenuto di glucosio utilizzando un protocollo di carico da 0,32 a 0,5 megapascal e cinque hertz per due ore al giorno.
Tra le procedure di carico, posizionare gli IVD in piastre a sei pozzi con sette millilitri di mezzo di coltura IVD per il recupero gratuito del gonfiore. Misurare l'altezza del disco ogni giorno con una pinza dopo il periodo di gonfiore libero e dopo il caricamento dinamico per la durata sperimentale. Dopo il primo ciclo di carico dinamico il primo giorno, posizionare direttamente gli IVD in una piastra di Petri in posizione verticale e stabilizzarli con una pinzetta.
Iniettare il TNF-alfa ricombinante con un ago di insulina calibro 30 lentamente ad una velocità di circa 70 microlitri al minuto negli IVD del gruppo patologico. Dopo l'iniezione, tirare la siringa a metà strada e tirare lo stantuffo per creare un vuoto che impedisce la fuoriuscita della soluzione iniettata, quindi rimuovere completamente la siringa dall'IVD. Il carico degenerativo combinato con un limitato apporto nutrizionale e un'iniezione TNF-alfa ha causato un aumento significativo dell'espressione genica dei marcatori pro-infiammatori interleuchina sei e interleuchina otto nel tessuto NP dopo quattro giorni di coltura.
L'interleuchina otto rilasci di proteine nel mezzo condizionato ha mostrato un marcato aumento del gruppo patologico nel secondo e quarto giorno. La riduzione dell'altezza del disco dopo il carico è stata più elevata nel gruppo patologico rispetto al gruppo fisiologico, e le differenze sono state più pronunciate dopo giorni due e tre rispetto al primo giorno, indicando un effetto progressivo delle condizioni degenerative e infiammatorie. Una tecnica standardizzata di dissezione è importante per i modelli di coltura di organi interi IVD riproducibili.
Un bioreattore è necessario per applicare carichi fisiologici e degenerativi su IVD per simulare varie condizioni biomeccaniche in vivo. Questa tecnica può essere applicata su espianto IVD umano che è di alta rilevanza clinica. È un nuovo modello preclinico per lo sviluppo di trattamenti efficaci sulla degenerazione del disco in fase iniziale.
