Questo protocollo è significativo, perché fornisce un metodo per separare quattro compartimenti cellulari l'uno dall'altro, il citoplasma, il nucleo, i mitocondri e la membrana. Non solo, ma è una procedura scalabile e riproducibile che ha risultati affidabili. Il vantaggio principale di questa tecnica è la separazione di quattro compartimenti cellulari con un utilizzo minimo di detergenti, che consente una procedura di frazionamento molto più riproducibile e affidabile.
Per l'isolamento delle proteine citosoliche, far crescere cellule U937 in RPMI 1640 con il 10% di siero bovino fetale a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per un totale finale di sei per 10 all'ottava cellula. Centrifugare la coltura e risospendere il pellet cellulare in PBS a temperatura ambiente a una concentrazione finale di quattro per 10 alla sesta cellula per millilitro, pipettando delicatamente per rompere i grumi. Dopo una seconda centrifugazione, risospendere il pellet nel tampone di lisi ghiacciato A ad una concentrazione finale di due per 10 alla settima cellula per millilitro.
Aggiungere 7,5 millilitri di cellule a un tubo conico sul ghiaccio per l'estrazione di proteine nucleari a valle e pellettare le celle rimanenti mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in tampone di isolamento citoplasmatico ad una concentrazione finale di due per 10 alle settima cellule per millilitro, pipettando delicatamente per rompere i grumi, prima di incubare le cellule per 20 minuti a quattro gradi Celsius con rotazione end-over. Al termine dell'incubazione, centrifugare la sospensione cellulare e trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga pulita.
Centrifugare il surnatante per sedimentare i detriti cellulari. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga e ripetere la sequenza di centrifugazione fino a quando non si osserva alcun pellet. Quando il campione è libero dai detriti, conservare il surnatante contenente la frazione citosolica per un massimo di un mese a quattro gradi Celsius.
Quindi risospendere il pellet cellulare immagazzinato nel tampone di lisi A ad una concentrazione finale di quattro per 10 alla sesta cellula per millilitro. Per l'omogeneizzazione cellulare, centrifugare la sospensione cellulare e scartare il surnatante per rimuovere i contaminanti in eccesso di digitonina e sistolica. Risospendere il pellet in tampone di omogeneizzazione di celle ghiacciate ad una concentrazione finale di quattro per 10 alla sesta cellula per millilitro per un'incubazione di 30 minuti sul ghiaccio.
Nel frattempo, per la lisi meccanica a base di perline, aggiungere 30 grammi di perline di acciaio inossidabile prelavato da 3,2 millimetri a 15 millilitri di tampone di lisi B in un tubo da 50 millilitri con bordo di ghiaccio per raffreddare. Al termine dell'incubazione, sostituire il tampone nel tubo a scopa con sospensione cellulare e frullare le cellule per cinque minuti alla velocità otto. Dopo la lisi, trasferire l'omogenato in un tubo pulito.
Centrifugare l'omogenato, quindi trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Per rimuovere eventuali residui dal campione, centrifugare l'omogenato tre volte come indicato, trasferendo il surnatante in una nuova provetta dopo ogni centrifugazione. Dopo l'ultima centrifugazione, per isolare la frazione mitocondriale grezza, trasferire il surnatante in una nuova provetta per la centrifugazione.
Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in un nuovo tubo e posizionare il pellet contenente frazione mitocondriale grezza su ghiaccio. Per isolare la frazione di membrana, centrifugare il surnatante raccolto e, dopo aver scartato il surnatante posizionare il pellet contenente la frazione di membrana grezza su ghiaccio. Per la purificazione del gradiente di densità isopicnica, risospendere i pellet grezzi della frazione mitocondriale e di membrana in 200 microlitri di tampone di lisi B e 1,8 millilitri di iodixanolo.
Per creare un gradiente di iodixanolo discontinuo per ciascun campione, in primo luogo, aggiungere un millilitro di iodixanolo al 15% sul fondo di un tubo ultracentrifuga a parete sottile da otto millilitri per campione. Successivamente, sottoporre sequenzialmente un millilitro di 20% iodixanol, un millilitro di 25% iodixanol, un millilitro di 30% iodixanolo e un millilitro di 35% iodixanolo sotto lo strato di 15% iodixanolo in ciascun tubo. Aggiungere due millilitri della sospensione di pellet mitocondriale grezzo sotto lo strato inferiore di un gradiente e due millilitri della sospensione di pellet di membrana grezza sotto lo strato inferiore del secondo gradiente.
Posizionare con cura un millilitro di 10% di iodixanolo sulla parte superiore di ciascun gradiente e bilanciare i tubi entro 10 microgrammi l'uno dall'altro aggiungendo il 10% di iodixanolo se necessario prima di purificare le frazioni mitocondriali e di membrana mediante centrifugazione a gradiente di densità. Alla fine della separazione, utilizzare un ago per perforare il lato dei tubi a parete sottile per raccogliere le bande visibili da ciascun campione. Per l'isolamento delle proteine nucleari, centrifugare l'aliquota da 7,5 millilitri di cellule sospese nel tampone di lisi A e risospendere il pellet in 800 microlitri di tampone di solubilizzazione delle celle ghiacciate con pipettaggio e vortexing.
Incubare la sospensione sul ghiaccio per 30 minuti per interrompere il plasma e le membrane degli organelli, proteggendo al contempo le proteine nucleari. Al termine dell'incubazione, centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet pipettando delicatamente 800 microlitri di tampone di lisi nucleare ghiacciato integrato con un'unità per microlitro di Benzonase. Incubare la miscela su un rotatore terminale a quattro gradi Celsius per interrompere la membrana nucleare.
Dopo 30 minuti, sonicare la miscela tre volte per cinque secondi al 20% di potenza con una pausa di cinque secondi tra gli impulsi per tagliare gli acidi nucleici. Dopo l'ultima sonicazione, centrifugare l'omogenato e raccogliere il surnatante come frazione nucleare senza disturbare il pellet. La macchia occidentale di ciascuna delle frazioni dopo la purificazione del gradiente di densità mostra la localizzazione della frazione mitocondriale negli strati di iodixanolo 25 e 30% e la localizzazione della frazione di membrana negli strati di iodixanolo 10 e 15%.
L'analisi del sangue occidentale conferma anche che ogni campione isolato è puro e privo di contaminazione da proteine provenienti da altre parti della cellula. Inoltre, l'analisi densitometrica dell'intensità della banda di ciascun campione conferma la riproducibilità e la significatività statistica dei dati. L'esecuzione impropria del frazionamento può causare la contaminazione incrociata dei componenti cellulari.
Un'alta concentrazione di istone H3 nella frazione citosolica, ad esempio, può essere dovuta a chiarificazione impropria della frazione citosolica. Il fallimento durante la purificazione della densità isopicnica può causare la contaminazione della frazione di membrana. Può essere utile eseguire un test di quantificazione delle proteine prima dell'analisi del sangue occidentale per confermare che le frazioni contengono effettivamente proteine per consentire il carico di gel in base alla quantità proteica e per confermare che la procedura è stata eseguita correttamente.
È fondamentale che la frazione citoplasmatica non contenga un pellet. Western blots, o ELISA possono essere eseguiti seguendo questa procedura per consentire di analizzare la posizione subcellulare di diverse proteine in determinate condizioni. Questa tecnica ci ha permesso di analizzare il traffico di diversi fattori di morte cellulare in condizioni di iperglicemia.
E così, per noi, questo ha contribuito a far luce sul meccanismo del passaggio iperglicemico dall'apoptosi alla necrosi.
