La PCR a goccia digitale offre maggiore precisione e sensibilità rispetto alla PCR quantitativa. Questo è un metodo semplice per la PCR a goccia digitale che richiede un'attrezzatura minima e nessuna esperienza. L'emulsificazione con modellazione di particelle è un metodo di emulsificazione privo di microfluidica che non richiede alcuna attrezzatura specializzata.
Inoltre, l'emulsione avviene in un periodo di secondi e si adatta al volume del contenitore. Per le perle commerciali, aggiungere 0,5 grammi di particelle di poliacrilammide essiccate compatibili con l'emulsione di modelli di particelle, o PTE, a 30 millilitri di acqua sterile in un tubo conico da 50 millilitri e mescolare bene. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Per la fabbricazione microfluidica di perline, versare un millilitro di fotoresist sul centro di un wafer di silicio da tre pollici, quindi ruotarlo a 500 RPM per 30 secondi, seguito da 1250 RPM per 30 secondi. Posizionare il wafer su una piastra elettrica impostata a 95 gradi Celsius per 15 minuti per far evaporare il solvente. Fissare la fotomaschera sul wafer di silicio con un vetrino di copertura ed esporre il wafer sotto un LED UV collimato per 2,5 minuti.
Posizionare il wafer su una piastra elettrica impostata a 95 gradi Celsius per cinque minuti per la cottura post esposizione. Sviluppare il wafer di silicio fotoresist immergendolo in un bagno di 100% PGMEA per un massimo di 15 minuti. Risciacquare il wafer con 100% PGMEA fresco, seguito da isopropanolo al 100%.
Asciugare all'aria il wafer, quindi asciugarlo su una piastra di cottura impostata a 95 gradi Celsius per un minuto e metterlo in una capsula di Petri da tre pollici pulita. Mescolare la base di silicio PDMS e il reagente di polimerizzazione in un rapporto 10: 1, quindi degasare il PDMS misto usando un essiccatore sotto vuoto fino a quando non sono osservabili bolle d'aria. Versare il PDMS degassato nella capsula di Petri, assicurandosi che il wafer di silicio sia completamente sommerso.
Degassare il wafer di silicio e il PDMS, quindi polimerizzare il PDMS mettendo il wafer di silicio in un forno impostato a 65 gradi Celsius per almeno 60 minuti. Asportare un blocco di PDMS contenente le caratteristiche microfluidiche della capsula di Petri, usando un bisturi. Perforare le prese e le uscite nel blocco PDMS usando un pugno bioptico da 0,75 millimetri.
Quindi rimuovere polvere e particolato con l'applicazione ripetitiva e la rimozione del nastro adesivo sulla superficie del blocco. Pulire un vetrino risciacquandolo con isopropanolo al 100% e successivamente asciugando all'aria la superficie. Il plasma tratta sia il vetrino che il PDMS con un millibar di plasma di ossigeno per un minuto, usando un bonder al plasma.
Applicare il PDMS al vetrino posizionando il PDMS trattato al plasma con caratteristiche rivolte verso il basso sul vetrino, lato trattato al plasma rivolto verso l'alto. Posizionare lo scivolo in un forno impostato a 65 gradi Celsius per almeno 30 minuti, per completare l'incollaggio. Trattare tutti i canali microfluidici con un trattamento superficiale fluorurato per garantire l'idrofobicità superficiale, quindi cuocere il dispositivo a 65 gradi Celsius per almeno 10 minuti.
Caricare siringhe contenenti soluzione sia la poliacrilammide, o PAA, che l'idrofluoroetere, o HFE, in pompe a siringa. Collegare entrambe le siringhe al dispositivo microfluidico utilizzando tubi di polietilene. Eseguire il dispositivo di generazione delle gocce e raccogliere un millilitro delle goccioline in un tubo di raccolta da 15 millilitri, quindi incubare per tre ore a temperatura ambiente per la polimerizzazione.
Dopo l'incubazione, rimuovere lo strato inferiore di olio mediante pipettaggio. Aggiungere un millilitro di PFO al 20% in olio di HFE al tubo di raccolta da 15 millilitri come demulsificatore chimico. Dopo la miscelazione, girare il tubo di raccolta da 15 millilitri a 2000 x g, per due minuti.
Rimuovere lo strato inferiore mediante pipettaggio e ripetere il processo ancora una volta. Aggiungere due millilitri di 2% di sorbitano monooleato in esano al tubo di raccolta da 15 millilitri e vorticarlo. Ruotare il tubo a 3000 x g per tre minuti e rimuovere il surnatante mediante pipettaggio per rimuovere la soluzione tensioattiva.
Ripeti l'operazione due volte. Aggiungere cinque millilitri di tampone TEBST e mescolare bene, quindi girare verso il basso a 3000 x g per tre minuti e rimuovere il surnatante mediante pipettaggio. Ripeti questo tre volte, quindi risospendi in cinque millilitri di TEBST.
Preparare le particelle di poliacrilammide per l'emulsione modellata con particelle centrifugando a 6000 x g per un minuto per pellettizzare le particelle. Quindi rimuovere il surnatante mediante pipettaggio e risospescere il pellet in acqua sterile. Ripetere tre volte per garantire la rimozione di eventuali RESIDUI DI TEBST.
Preparare la fase di dispersione in un tubo di centrifuga fresco da 15 millilitri, utilizzando una miscela master PCR, i primer appropriati e una sonda di idrolisi della fluoresceina, come descritto nel manoscritto di testo. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti sotto delicata agitazione, usando un rotatore a tubo. Centrifugare la fase di dispersione a 6000 x g per un minuto e rimuovere il surnatante.
Aggiungere un microlitro di DNA genomico Saccharomyces cerevisiae al pellet e mescolare accuratamente mediante pipettaggio o picchiettamento vigoroso. Aggiungere 200 microlitri di fluorotensioattivo al 2% in olio di HFE al tubo, per l'emulsione. Rimuovere il pellet tubando o picchiettando il tubo, quindi vortice a 3000 RPM per 30 secondi.
Lasciare che le emulsioni si depositino per un minuto, quindi rimuovere 100 microlitri della fase oleosa inferiore e sostituire questo volume con fluorotensioattivo fresco al 2% in olio di HFE. Capovolgere delicatamente il tubo più volte per mescolare. Ripeti questo tre volte o più, fino a quando le piccole goccioline satellitari non vengono rimosse.
Dopo due o cinque minuti di assestamento, rimuovere la fase di olio inferiore. Sostituire questo volume con il 5% di fluorotensioattivo in olio di fluorocarburi. Pipettare 100 microlitri di campione in tubi PCR da 200 microlitri e posizionare i tubi PCR in un termociclatore.
Pipettare il campione su un vetrino di conteggio per l'imaging fluorescente e visualizzare il campione. L'emulsione con modellazione di particelle offre una superba monodispersità. Quando il surnatante in eccesso viene rimosso, viene aggiunto tensioattivo stabilizzante e il campione viene vorticoso per generare l'emulsione.
Le goccioline risultanti sono costituite da nucleo di particelle e campione acquoso contenente reagenti e molecole campione o cellule necessarie per la reazione. Le goccioline polidisperse con particelle di template indicano un vortice insufficiente. Un altro problema è la generazione di satelliti eccessivi, che riducono l'efficienza di incapsulamento.
I satelliti non dovrebbero comprendere più del 10% del volume totale del campione incapsulato. Possono essere eliminati dall'emulsione lavando con olio fresco. L'utilità del PTE può essere dimostrata nella PCR digitale quando le goccioline contenenti bersagli amplificati diventano fluorescenti, consentendo la quantificazione diretta dei bersagli.
Le goccioline fluorescenti producono pochi positivi quando il bersaglio è raro e molti quando è abbondante. Questi risultati sono ripetibili utilizzando particelle di poliacrilammide disponibili in commercio, ottenendo misurazioni accurate nello stesso intervallo. La rimozione del surnatante dalla fase di dispersione è importante per l'incapsulamento del campione.
Conoscere il volume del pellet e del surnatante può aiutare a identificare l'interfaccia tra i due. In caso di dubbio, errare sul lato della rimozione del surnatante.
