In medicina rigenerativa, un solido protocollo di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti verso uno specifico tipo di cellula neurale è uno strumento prezioso. Nel nostro caso, questi protocolli sono stati molto utili per studiare sia lo sviluppo del glioblastoma che il morbo di Parkinson. Quindi, in primo luogo, la generazione di organoide tridimensionale ha il vantaggio di imitare da vicino lo sviluppo fisiologico, e anche la produzione di neurosfere calibrate dalle dimensioni da cellule staminali pluripotenti ha un'alta riproducibilità.
La seguente procedura sarà dimostrata da Manon Locatelli, dottorando del nostro laboratorio. 24 ore prima di iniziare la coltura triD, sostituire il mezzo hESC con un mezzo privo di siero integrato con un inibitore ROCK a 10 micromolari. Le celle devono essere al 60% di confluenza.
Il giorno dopo, staccare le colonie hESC come singole cellule rimuovendo il mezzo e risciacquando con PBS privo di calcio e magnesio. Quindi, aggiungere cinque millilitri di soluzione enzimatica di dissoluzione e incubare a 37 gradi Celsius per uno o due minuti. Successivamente, raccogliere le cellule in mezzo privo di siero con inibitore ROCK 10 micromolare e centrifugare le cellule a 300 volte g per cinque minuti.
Dopo la centrifugazione, controllare le dimensioni del pellet cellulare. Rimuovere il supernatante e contare le cellule in 10 millilitri di mezzo privo di siero integrato con inibitore ROCK 10 micromolare. In parallelo, sciacquare la piastra microwell con due millilitri di mezzo privo di siero per pozzo e centrifugare la piastra a 1.200 volte g per cinque minuti per rimuovere tutte le bolle al fine di prevenire la formazione di neurosfera.
Successivamente, preparare 28,2 milioni di cellule in 12,5 millilitri di mezzo privo di siero integrato con inibitore ROCK 10 micromolare. Erogare 1.000 cellule per microwell. Centrifugare le cellule a 300 volte g per cinque minuti e controllare la ripartizione omogenea delle cellule nella piastra del microwell al microscopio.
Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, esaminare la piastra del microwell per controllare la dimensione delle sfere formate in ogni microwell. Trasferire le sfere su una piastra a sei porti utilizzando il mezzo integrato con un cocktail di inibizione dual-SMAD per promuovere una rapida induzione neurale.
Da questo passo in avanti, le sfere sono coltivate in rotazione a 60 giri/min per evitare che si attacchino insieme o alla piastra. Dal primo al quarto giorno, cambia il mezzo ogni due o tre giorni prima di eseguire l'induzione neurale. Dal quarto all'11° giorno, promuovere la proliferazione delle rosette neurali derivate da hESC aggiungendo EGF e bFGF a 10 nanogrammi per millilitro al mezzo B27 integrato con cocktail dual-SMAD.
Dal giorno 11 al 13, coltura le sfere in mezzo B27 integrate con inibitore BMP 0,5 micromolare. Dal giorno 13 al 21, coltura le sfere in mezzo B27 integrate con GDNF e BDNF a 10 nanogrammi per millilitro e un inibitore della gamma-secretasi micromolare. Il giorno 21, posizionare un inserto in una piastra di coltura in un unico pozzo di un nuovo piatto a sei pozzi.
Successivamente, aggiungere un millilitro di mezzo B27 integrato con fattori di crescita e inibitori ad ogni pozzo sotto l'inserto della membrana. Successivamente, placcare le sfere su una membrana PTFE idrofila depositata su un inserto di piastra di coltura e cambiare il mezzo ogni due o tre giorni per le successive tre settimane di differenziazione. Interrompere la rotazione da questo passaggio.
La presenza di rosette indica l'inizio della differenziazione neurale. Dal giorno 21 al 25, coltivare organoidi neurali umani nello stesso mezzo di maturazione neurale. Quindi, dal giorno 25 al 28, integrare solo il mezzo B27 con un inibitore della gamma-secretasi micromolare.
Dal giorno 28 al 39, smetti di aggiungere l'inibitore della gamma-secretasi e continua la coltura organoide neurale umana solo nel mezzo B27. Dopo tre settimane, gli organoidi neurali sono pronti per l'uso per l'impianto GIC. Il giorno zero, amplificare gli HESC in impostazioni cultura two-D fino al 60% di confluenza.
Quindi, sostituire il mezzo di cellule staminali utilizzato per mantenere le caratteristiche di pluripotenza degli hESC con un mezzo privo di siero contenente cocktail di inibizione dual-SMAD per iniziare l'induzione neurale e l'inibitore rock 10-micromolare per aumentare il tasso di sopravvivenza delle cellule durante il passaggio il giorno successivo. Il primo giorno, preparare la piastra microwell con 2,5 millilitri per pozzo di mezzo privo di siero contenente la stessa concentrazione di molecole di inibitore ROCK e doppia inibizione SMAD. Per differenziare le cellule verso il modello ventrale del tubo neurale, aggiungere SHH e FGF8 a 100 nanogrammi per millilitro e due micromolari levigati agonisti.
Dopo aver aggiunto il mezzo, centrifugare la piastra a 1.200 volte g per cinque minuti per rimuovere le bolle d'aria dai microwell. Una volta che la piastra microwell è pronta per l'uso con mezzo mezzo di differenziazione, rimuovere il mezzo di hESC e lavare rapidamente con PBS privo di calcio e magnesio. Dissociare le colonie in una sospensione monoscheda aggiungendo 7,5 millilitri di soluzione enzimatica ricombinante in un pallone T75.
Incubare le cellule per due minuti a 37 gradi Celsius e quindi aggiungere 7,5 millilitri di DMEM F12. Successivamente, raccogliere la sospensione cellulare e la centrifuga a 300 volte g per cinque minuti. Quindi, rimuovere il supernatante e contare le cellule nello stesso mezzo utilizzato per preparare la piastra del microwell.
Regolare il volume medio per ottenere una sospensione cellulare che consenta di formare neurosfere contenenti 1.000 cellule per microwell preparando 4,7 milioni di cellule in 2,5 millilitri di mezzo e aggiungendolo ai precedenti 2,5 millilitri di mezzo già collocati nella piastra. Per distribuire correttamente le cellule in ogni microwell, agitare delicatamente la piastra e centrifugarla a 300 volte g per cinque minuti. Successivamente, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore per generare sfere.
Il secondo giorno, sciacquare delicatamente i microlitri con mezzo e trasferire le sfere in una piastra a sei pozzi trattata con tessuti. Posizionare le sfere in rotazione a 37 gradi Celsius e cambiare metà del mezzo con mezzo fresco ogni due o tre giorni. Dal terzo al 13° giorno, per migliorare l'induzione neurale e convertirsi in progenitori neurali con un'identità di midbrain, integrare il mezzo con inibitore GSK-3-beta a tre micromolari.
Dividere il campione in due nuove piastre a sei pozzi trattate con tessuti per ridurre la densità della sfera ed evitare l'aggregazione della sfera. All'ottavo giorno, inizia la maturazione neurale passando a un nuovo mezzo con fattori di crescita e cambia il mezzo ogni due o tre giorni. Il giorno 21, posizionare un inserto in una piastra di coltura in un pozzo di una nuova piastra a sei porsi e aggiungere 1,2 millilitri di mezzo di maturazione neurale utilizzato per la differenziazione della neurosfera sotto l'inserto della membrana.
Quindi, deporre la membrana PTFE su un inserto di piastra di coltura. Infine, per generare l'organoide neurale, seminare circa 100 neurosfere in condizioni di interfaccia aria-liquido sulla membrana PTFE. Interrompere la rotazione da questo passaggio e cambiare il mezzo ogni due o tre giorni fino a raggiungere il punto di differenziazione richiesto.
Ecco uno schema di un protocollo standardizzato per la generazione di organoidi neurali dopaminergici. L'analisi dell'immunofluorescenza degli organoidi neurali dopaminergici mostrata in queste immagini indica cellule immunoreattive TH coesprimendo Nurr1, un marcatore specifico del midbrain. Questi due grafici rappresentano la cinetica dell'espressione genica TH e Nurr1 valutata da RT-PCR quantitativo.
Ecco un esempio di dati grezzi registrati con la piattaforma MEA. Ogni picco viene visualizzato da una linea verticale, mentre la traccia rimanente è rumore. E questa immagine rappresenta una neurosfera depositata sul MEA.
Questi grafici mostrano la sovrapposizione dei picchi tipici rilevati dai dati grezzi. La curva grassetto nera indica la media delle curve rosse corrispondenti. Questo grafico raster mostra i timestamp associati a ogni picco rilevato.
I diversi colori evidenziano i diversi elettrodi. Questi protocolli consentono al ricercatore di rispondere a domande sull'interazione delle cellule tumorali con organoide neurale e lo screening diretto con organoide dopaminergico.
