Lo scopo di questo protocollo è quello di visualizzare gli aggregati di eterocromatina nelle cellule di Drosophila. Per raggiungere questo obiettivo, usiamo cellule di politene che si trovano nelle ghiandole salivari di terze larve instar Il genoma di queste cellule è amplificato quasi mille volte e i cromosomi conservano le caratteristiche delle cellule di interfaccia. Hanno telomeri ben definiti, e ponti chiamati cromocentro in cui tutti i centromeri si aggregano, ed è principalmente eterocromatico.
Utilizzando il terzo tessuto di larve instar, ci permettono anche di valutare il cambiamento degli aggregati eterocromatici nel background di diversi mutanti genetici. Per ottimizzare la terza cultura delle larve instar, dovrai prima raccogliere adulti di età da 5 a 10 giorni e mettere circa 50 in una bottiglia ampia del collo di un supporto standard. 25 maschi e 25 femmine.
Posizionare la bottiglia in un incubatore a temperatura controllata a 25 gradi Celsius per 12 ore. Al termine del tempo di incubazione, rimuovere gli adulti e trasferirli in una nuova bottiglia per ripetere la procedura. Lascia che gli embrioni crescano a 18 gradi Celsius per 22 ore.
Per la raccolta delle larve, assicurati di scegliere le larve errante, che non hanno sferici troppo. Sezionare 15 paia di ghiandole salivari, o il più possibile in 30 minuti di tempo in PBS freddo con inibitori di protesta al microscopio. Trasferire le ghiandole salivari in un altro tubo con PBS ghiacciato.
Lavare una volta con PBS freddo più inibitori delle proteste. Ricorda, aspetta sempre che il tessuto raggiunga il fondo del tubo. Dopo aver rimosso il PBS dall'ultimo passaggio, aggiungere direttamente 0,5 millilitri di un tampone di fissazione della gomma del gruppo X e il 50% di metanolo più il 2% di formaldeide.
Incubare per due ore a quattro gradi Celsius con una leggera rotazione. Eseguire un lavaggio a rotazione di cinque minuti con tampone Tris-Triton, aggiungendo un millilitro. Attendere sempre che il tessuto raggiunga il fondo del tubo.
Nota: attendere che il tessuto raggiunga il fondo del tubo. Incubare le ghiandole salivari con Tris-Triton, lo stesso di cui sopra, più l'1% di beta mercaptoetanolo per due ore a 37 gradi Celsius con lievi scosse. Lavare con tampone BO3 e incubare con BO3 più 10 DTT millimolare a 37 gradi Celsius con lievi scosse per 15 minuti.
Alla fine del periodo di incubazione, eseguire un lavaggio con un millilitro di tampone BO3 da solo. Incubare le ghiandole salivari in un millilitro del tampone B per due ore a temperatura ambiente con rotazione. Rimuovere tutto il buffer B e aggiungere tampone A più anticorpo di interesse.
In questo caso, utilizziamo HP uno, A C 1 8 9 della banca Iridium. 1 su 3.000 nella notte a quattro gradi con rotazione. A questo punto è importante che lo scuotimento non sollevi bolle, che potrebbero danneggiare l'anticorpo.
Dare trattare per 15 minuti lavaggi con tampone B, sotto agitazione a temperatura ambiente utilizzando un millimetro ogni volta. Le ghiandole vengono trasferite al tampone B insieme alla coppia antibiotica secondaria a un pavimento si riferiscono per due ore, sotto rotazione a quattro gradi. In questa fase, è importante coprire il tubo con un foglio di carta in alluminio per proteggere l'anticorpo secondario dalla luce.
Effettuare rondelle di 2x15 minuti a temperatura ambiente, mentre la rotazione con un millilitro di tampone B.Incubare con un marcatore di DNA come Sydox o OH, e sciogliere in un millilitro del tampone B per 10 minuti a temperatura ambiente con rotazione. Effettuare un lavaggio con tampone B e una volta con PBS, ogni lavaggio della durata di 10 minuti, ruotando a temperatura ambiente. Infine, montare le ghiandole salivari su uno scivolo, facendo una piscina con una copertura scivolare.
Metti le ghiandole salivari al centro della piscina e copri con Sidiflor. Per evitare la deformazione della bolla, estendere il liquido viscoso dappertutto. Quindi, sigillare tutti gli scivoli con smalto chiaro.
Osservare sotto una fluorescenza o un microscopio confocale. Se il campione non verrà osservato lo stesso giorno, conservare dalla luce a quattro gradi. I risultati rappresentativi della monostaining HB1 nelle ghiandole salivari della Drosophila sono riportati nella prima figura.
Un risultato positivo è osservare un punto focale come in A, aggregato cromatico atero o condensa. Un risultato negativo è nessun segnale o segnale disperso. A volte, un doppio segnale può essere osservato come un doppio punto in C, ma di solito si verifica in quantità minori.
Per analizzare i dati possono essere rappresentare come un grafico a barre, confrontando la distribuzione di HP1 con diversi sfondi mutanti. Ad esempio, nella figura due, possiamo vedere che il 98% dei nuclei presenta una distribuzione di un punto. E il 2% di due fuochi di tipo selvaggio.
Nel mutante, la proporzione è cambiata e la presenza di due fuochi è aumentata al 40%La figura tre mostra la lisina di trietilazione rappresentativa 9H3 nella monostaining. Risultato in Drosophila ghiandole salivari osservando un punto focale in B, è un risultato favorevole all'aggregato cromatico o alla condensa, un segnale doppio o triplo in C può vedere in rare occasioni, ma in piccole quantità. Alla fine di questo protocollo, sarai in grado di vedere un condensato diapomatico di proteine HP1 nonostante le limitazioni di stato, sarà un buon primo approccio.
