Questo protocollo aiuta a comprendere il reclutamento spaziale e temporale delle proteine di riparazione del danno al DNA, prendendo in considerazione la fase del ciclo cellulare. Per la discriminazione del ciclo cellulare, utilizziamo pcNA con tag proteina fluorescente come marcatore della fase S, che aggira gli artefatti introdotti da altri metodi di sincronizzazione del ciclo cellulare. Questo, combinato con la microirraggiamento basato su laser, offre una risoluzione spaziotemporale senza precedenti alla cinetica delle proteine di riparazione del danno al DNA.
Il successo nell'utilizzo di routine del nostro protocollo si basa sulla conoscenza di base dell'imaging confocale. 24 ore prima della microirraggiamento, piastra un totale di otto per 10 alle quarte celle in 500 microlitri a un millilitro di mezzo su un vetro di copertura a quattro pozzetti. Un'ora prima della microirraggiamento, scambiare il mezzo di crescita regolare con un mezzo di imaging contenente olaparib o un controllo del veicolo come DMSO.
Almeno quattro ore prima dell'imaging, accendere la camera ambientale e i componenti del microscopio. Accendere il riscaldamento, l'alimentazione di anidride carbonica e il regolatore di umidità. Inizializzare le sorgenti luminose insieme alle linee laser almeno un'ora prima di trasferire le cellule al microscopio.
Oliare l'obiettivo del microscopio e posizionare un vetro di copertura camerato sotto il microscopio. Per selezionare le cellule della fase S in una popolazione asincrona, esaminare attraverso l'oculare il modello di localizzazione univoco del PCNA mPlum taggato in fase S e selezionare un campo visivo che abbia abbastanza celle di fase S per la micro-irradiazione. Impostare la regione di interesse per la microirraggiamento utilizzando il software associato per inserire linee binarie.
Per impostare il numero desiderato di linee e spaziatura, fare clic su binario, quindi selezionare Inserisci linea, cerchio ed ellisse per disegnare il numero desiderato di linee, quindi convertire queste linee binarie in ROI di stimolazione facendo clic su ROI, spostare binario in ROI, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse su uno qualsiasi dei ROI e selezionare Usa come stimolazione ROI S1. Posiziona queste linee nel campo visivo in modo che passino attraverso il nucleo delle cellule. Prima della microirraggiamento, per identificare i focolai PCNA per un'analisi successiva, scatta un'immagine a risoluzione più elevata del campo visivo impostando i parametri necessari nella GUI compatta LFOV A1 e nelle finestre dell'area di scansione LFOV A1, quindi premendo il pulsante di acquisizione. Per impostare la microirraggiamento, aprire la scheda di stimolazione ND, quindi accedere alla finestra temporale per acquisire una serie di immagini di pre-stimolazione e quindi una serie di immagini post-stimolazione utilizzando gli scanner Galvano.
Impostare tre fasi nella finestra di pianificazione temporale. Nella colonna acquisizione e stimolazione, selezionare l'acquisizione, la stimolazione e l'acquisizione rispettivamente per le tre fasi. Per la fase di stimolazione, impostare S1 come ROI.
Nella finestra Galvano XY, impostare la potenza di uscita laser al 100% per la linea laser a 405 nanometri e impostare il tempo di permanenza per la microirraggiamento. Per impostare l'imaging timelapse per la finestra temporale e gli intervalli desiderati, utilizzare la GUI compatta A1 LFOV e le finestre dell'area di scansione A1 LFOV. Ottimizza la percentuale di potenza del laser, il guadagno e le impostazioni di offset per ridurre lo sbiancamento delle foto durante l'imaging nella finestra GUI compatta A1 LFOV.
A seconda della cinetica della proteina, estendere o abbreviare l'intervallo tra le immagini o la durata del timelapse totale impostando l'intervallo e la durata desiderati per la riga di acquisizione della terza fase nella finestra del programma temporale. Premere run now per eseguire la microirraggiatura e il successivo timelapse imaging. Al termine dell'imaging timelapse, salvare i ROI di stimolazione come immagini separate, che saranno utili per identificare le coordinate di microirraggiamento in qualsiasi software a valle utilizzato per l'analisi.
Il PCNA ha una distribuzione completamente omogenea nel nucleo nelle fasi G1 e G2. Nella fase S, PCNA si localizza in siti di replicazione del DNA, che possono essere visualizzati come punti luminosi nel nucleo. Nelle prime cellule della fase S, le macchie sono relativamente piccole e equamente distribuite in tutto il nucleo della cellula.
Mentre progrediscono nella fase S media, le macchie diventano sfocate e si localizzano maggiormente verso il perimetro del nucleo e dei nucleoli. Nella fase S tardiva, le macchie si riducono di numero, ma diventano sempre più grandi man mano che il PCNA si concentra nei siti di replica tardiva. Basse dosi di energia, come 1.000 microsecondi di tempo di permanenza, non inducono il reclutamento di EGFP-FBXL10, un responder di rottura a doppio filamento, ma sono sufficienti per indurre il reclutamento di NTHL1-mCherry, una proteina del percorso di riparazione dell'escissione di base che viene reclutata nei siti di danno ossidativo al DNA.
A 3.000 microsecondi di tempo di permanenza, vengono reclutati sia EGFP-FBXL10 che NTHL1-mCherry, dimostrando un'uscita laser che genera sia lesioni ossidative che rotture a doppio filamento. EXO1b raggiunge un livello massimo di accumulo e siti di micro-irradiazione circa un minuto, per poi iniziare lentamente a disimpegnarsi dalle lesioni del DNA. In presenza di olaparib, l'accumulo di EXO1b sulla striscia laser in un minuto è significativamente inferiore rispetto al controllo del veicolo.
È fondamentale che al microscopio venga dato ampio tempo per riscaldarsi e che la cultura e le condizioni siano ottimali per ogni esperimento per garantire risultati coerenti. Inoltre, è importante ottimizzare le impostazioni laser con diversi reporter di danni al DNA per testare specifiche lesioni del DNA. Dopo la microirraggiamento, considerare la convalida dei risultati con metodi biochimici classici, come il frazionamento, l'immunoprecipitazione o la ChIP.
Questi approcci campionano una popolazione cellulare più ampia, fornendo così forza statistica.
