Ringraziamo per Fabiana Benatti per la sua gentile collaborazione nel video. Ringraziamo anche FAPESP (# 2007/51228-0) e CNPq (# 300133/2008-1) per il sostegno alle nostre ricerche su questo settore.

Introduzione L&#39;energia necessaria per sostenere uno sforzo fisico proviene da due fonti metaboliche: metabolismo aerobico e anaerobico. Mentre il metabolismo aerobico è più efficiente del metabolismo anaerobico (cioè, produce una maggiore quantità di ATP per mole di substrato), produzione di energia tramite il metabolismo anaerobico in grado di fornire una elevata quantità di energia in un periodo di tempo molto breve. Questo può essere decisivo per qualsiasi situazione che richiede movimenti estremamente veloci. Ogni sport ha caratteristiche specifiche in termini di abilità motorie che conferiscono particolari esigenze fisiologiche e metaboliche per quel particolare sport. L&#39;aspetto più importante la richiesta metabolica è il contributo relativo dei sistemi energetici per l&#39;energia totale necessaria per l&#39;attività. Per determinare la domanda specifica di ogni sport è fondamentale per lo sviluppo di modelli di formazione ottimizzati, strategie nutrizionali e ausili ergogenici che possono massimizzare unaprestazioni thletic. Alcuni sport sono relativamente facili da riprodurre in laboratorio, quindi è possibile creare un ambiente controllato in cui gli atleti possono essere valutati. Questo è il caso di corsa e la bicicletta, per esempio. Movimenti prevedibili comporre questi sport e, quindi, sono facili da studiare. Utilizzando alcune attrezzature semplici, è possibile simulare abbastanza esattamente gli stessi movimenti che gli atleti si esibiscono in situazioni reali, quali la formazione e concorsi. Infatti, questi sport sono stati più ampiamente studiato dagli scienziati di esercizio e ha beneficiato di una letteratura più completo ed affidabile scientifica. D&#39;altra parte, un certo numero di sport sono molto più difficili da riprodurre in laboratorio. Questi sport sono imprevedibili e in funzione delle azioni del partner (s) e l&#39;avversario (s). Questo porta ad una incapacità di riprodurre fedelmente le condizioni di concorrenza in laboratorio e l&#39;incapacità di assess questi atleti in campo sia durante la formazione o la concorrenza. Forse a causa di questi problemi, che hanno ricevuto molta meno attenzione dagli scienziati. Questo è il caso della maggior parte degli sport di squadra e molti sport individuali 1. Considerando questi aspetti, abbiamo voluto descrivere come valutare il contributo differenziale dei sistemi energetici nello sport che sono difficili da riprodurre in condizioni controllate di laboratorio. Perché il judo è uno sport molto complesso e imprevedibile, useremo judo come esempio. Tuttavia, i concetti mostrati qui può essere adattata a un numero di discipline sportive. 1. Misurazioni fisiologiche a riposo <ol><li> Misurare la massa corporea dell&#39;atleta prima di lui / lei inizia l&#39;esercizio. </li><li> Prima di iniziare l&#39;esercizio, raccogliere un piccolo campione di sangue dal lobo dell&#39;orecchio a riposo o delle dita e tenerlo in ghiaccio fino a quando tutta la procedura sperimentale è terminata. </li><li> In seguito, posizionare il calibrated analizzatore portatile gas nella posizione più conveniente, che dipende dai movimenti che l&#39;atleta eseguirà ed il consumo di ossigeno registrare riposo o basale per cinque minuti. Durante la misurazione basale, l&#39;atleta deve rimanere in posizione eretta sulle sue piedi (se l&#39;esercizio verrà effettuata in posizione eretta) o seduto in un materiale che sarà utilizzato (se l&#39;esercizio verrà effettuata in uno o in cicloergometro qualsiasi apparecchiatura simile). </li></ol> 2. Misurazioni fisiologiche durante l&#39;allenamento <ol><li> Dopo aver raccolto campioni di sangue e di riposo a riposo il consumo di ossigeno, si può chiedere all&#39;atleta di iniziare l&#39;esercizio specifico che si sta studiando. L&#39;analizzatore di gas portatile deve essere collocato in una posizione che non interferisce con l&#39;esercizio fisico e che l&#39;esercizio non danneggiare l&#39;apparecchiatura. Continua la misurazione del consumo di ossigeno per tutto il periodo di esercizio. </li></ol> 3. Misurazioni fisiologiche dopo l&#39;esercizio </p&gt; <ol><li> Dopo aver raccolto i dati di esercizio del consumo di ossigeno, mantenere il consumo di ossigeno di registrazione per dieci minuti prima di spegnere l&#39;apparecchio verso il basso. Sempre ricalibrare l&#39;analizzatore di gas se più di un atleta viene valutata nello stesso giorno. </li><li> Al fine di individuare il picco di lattato plasmatico dopo l&#39;esercizio, raccogliere piccoli campioni di sangue subito dopo minuti di esercizio, tre, cinque e sette dopo l&#39;esercizio. Tenerli in ghiaccio fino al momento dell&#39;analisi. </li></ol> 4. Campioni di sangue di trasformazione e Peak Determinazione plasmatica del lattato <ol><li> Tutti i campioni di sangue deve essere collocato in microprovette contenenti un volume analogo di una soluzione al 2% NaF (cioè, se si raccolgono 25 pl di sangue, porlo in 25 pl del 2% NaF). </li><li> Quando la raccolta dei dati è terminata, plasma separato da eritrociti rotazione dei campioni per 5 minuti a 2000 ga 4 ° C. </li><li> Lattato plasma può essere determinata attraverso una varietà di methods2, 3. Nel nostro laboratorio, si usa il meth elettrochimicaod con l&#39;ausilio di un analizzatore di lattato automatizzata (Yellow Springs 1500 Sport, Ohio). </li></ol> 5. Calcoli <ol><li> Calcolare l&#39;energia netta generata dal metabolismo aerobico sottraendo il consumo di ossigeno resto dal consumo di ossigeno esercizio. Il consumo di ossigeno a riposo si ottiene moltiplicando la media degli ultimi 30 secondi di consumo di base di ossigeno per il tempo totale durata dell&#39;esercizio. Quindi, calcolare l&#39;area sotto la curva del consumo di ossigeno esercizio utilizzando il metodo trapezoidale. Infine, sottrarre il consumo di ossigeno a riposo dal consumo di ossigeno esercizio. </li><li> Il contributo del metabolismo anaerobico alactic (cioè, l&#39;ATP-CP via) può essere considerato come il componente veloce eccesso di post-esercizio consumo di ossigeno 4-6, come illustrato nella figura 1. Calcolare l&#39;energia prodotta dal sistema di montaggio alactic la cinetica di post-esercizio fisico il consumo di ossigeno ad un bi-o un monoexponential curva. Ciò può essere fatto con l&#39;ausilio di software matematica &#39;(es. versione Microcal Origin 7,0). Scegli la curva mono o bi-esponenziale in base al modello che meglio si adatta al vostro set di dati (cioè il più basso residuo). Quindi, usare i termini previsti dalla dell&#39;equazione interpolata (Equazione 1) per calcolare il contributo alactic secondo l&#39;equazione 2. <img src="/files/ftp_upload/3413/3413fig1.jpg" alt="Fiugre 1" /> Figura 1. Illustrazione schematica di una tipica curva di consumo di ossigeno ottenuto a riposo, durante, e dopo l&#39;esercizio. Equazione 1: <img src="/files/ftp_upload/3413/3413eq1.jpg" alt="Equazione 1" /> Equazione 2: <img src="/files/ftp_upload/3413/3413eq2.jpg" alt="Equazione 2" /> dove V O2 (t) è l&#39;assorbimento di ossigeno al tempo t, V è O2baseline consumo di ossigeno al basale, A è l&#39;ampiezza, δ è il tempo di ritardo, τ è una costante di tempo,e 1 e 2 indicano i componenti veloce e lenta, rispettivamente. </li><li> Per calcolare il contributo del sistema lattico anaerobico, si presume che 1 mM di lattato di sopra dei valori a riposo corrisponde a 3 mL di ossigeno consumato per chilogrammo di mass7. Così, calcolare delta picco del lattato del plasma (cioè, il picco plasmatico lattato meno plasmatica del lattato a riposo) e moltiplicarlo per 3, e dalla massa corporea dell&#39;atleta. Il valore ottenuto in mL di ossigeno viene poi convertito in L e di energia (kJ), assumendo che ogni 1 L di O 2 è pari a 20,92 kJ. </li><li> Infine, il risultato ottenuto da ciascun sistema energetico si riassume in modo da avere il totale delle spese di energia durante l&#39;attività e il contributo relativo di ciascun sistema può essere calcolato. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Figura 2 illustra una curva rappresentativa di consumo di ossigeno a riposo, durante l&#39;esercizio e dopo l&#39;esercizio. Nelutilizzato in questo esempio, gli atleti eseguito tre diverse tecniche di judo (o-uchi-gari, harai-goshi e seoi-nage) per cinque minuti un tiro ogni 15 s) 8. Questa è una tipica risposta all&#39;esercizio intermittente. Dopo i calcoli, abbiamo ottenuto i risultati finali relative al contributo dei sistemi di energia durante gli esercizi di Judo (Tabella 1). Ulteriori risultati rappresentativi sono illustrati nella tabella 2. In questo esempio, rocciatori interne di diversi livelli competitivi (ad esempio, ricreativi vs elite) sono stati valutati nel corso di una low-Difficoltà salita. I risultati individuali di un atleta elite e un atleta da diporto sono riportati (Tabella 2). <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2"> Seoi-nague </td><td colspan="2"> Harai-goshi </td><td colspan="2"> O-uchi-gari </td></tr><tr><td> kJ </td><td> % </td><td> kJ </td><td> % </td><td> kJ </td><td> % </td></tr><tr><td> Anaerobica alactic </td><td> 46 ± 20 </td><td> 16,3 ± 2,8 </td><td> 43 ± 21 </td><td> 16,1 ± 2,7 </td><td> 36 ± 22 </td><td> 14,6 ± 2,8 </td></tr><tr><td> Aerobico </td><td> 223 ± 66 </td><td> 82,2 ± 2,9 </td><td> 211 ± 66 </td><td> 82,3 ± 3,8 </td><td> 196 ± 74 </td><td> 84,0 ± 3,8 </td></tr><tr><td> Lattica anaerobica </td><td> 4 ± 2 </td><td> 1,5 ± 0,7 </td><td> 5 ± 5 </td><td> 1,6 ± 1,4 </td><td> 4 ± 4 </td><td> 1,5 ± 1,1 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 273 ± 86 </td><td>- </td><td> 259 ± 91 </td><td> - </td><td> 237 ± 99 </td><td> - </td></tr><tr><td> Totale (kJ / min) </td><td> 51,9 ± 8,7 </td><td> - </td><td> 49,4 ± 8,9 </td><td> - </td><td> 45,3 ± 19,6 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Risultati rappresentativi del dispendio energetico totale e il contributo dei sistemi energetici nel corso di tre esercizi di judo diversi. <table border="1"><tbody><tr><td> Livello agonistico </td><td> Aerobica (%) </td><td> Lattica anaerobica (%) </td><td> Alactic anaerobica (%) </td><td> Totale (kJ) </td><td> Totale (kJ / s) </td></tr&gt; <tr><td> Elite </td><td> 40 </td><td> 8 </td><td> 52 </td><td> 70,4 </td><td> 1,00 </td></tr><tr><td> Ricreativo </td><td> 40 </td><td> 15 </td><td> 45 </td><td> 96,1 </td><td> 1,15 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Rappresentativi i dati individuali di dispendio energetico totale e il contributo dei sistemi energetici nel corso di una low-Difficoltà salita. <img src="/files/ftp_upload/3413/3413fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Risultati ottenuti durante rappresentativi a 5 minuti di esercizio di judo.

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	<li>Franchini, E., Del Vecchio, F. B., Matsushigue, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+profiles+of+elite+judo+athletes.">Physiological profiles of elite judo athletes.</a> Sports Med. 41, 147-166 (2011).</li><li>Bergmeyer, H. U., Bergmeyer, J., Grassl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods of enzymatic analysis. , (1983).</li><li>Passonneau, J. V., Lowry, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Analysis.">Enzymatic Analysis.</a> A Practical Guide. , (1993).</li><li>Beneke, R., Pollmann, C., Bleif, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+anaerobic+is+the+Wingate+Anaerobic+Test+for+humans.">How anaerobic is the Wingate Anaerobic Test for humans.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 87, 388-392 (2002).</li><li>Beneke, R., Beyer, T., Jachner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+karate+kumite.">Energetics of karate kumite.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 92, 518-523 (2004).</li><li>Bertuzzi, R. C. D., Franchini, E., Kokubun, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+system+contributions+in+indoor+rock+climbing.">Energy system contributions in indoor rock climbing.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 101, 293-300 (2007).</li><li>di Prampero, P. E., Ferretti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+anaerobic+muscle+metabolism:+a+reappraisal+of+older+and+recent+concepts.">The energetics of anaerobic muscle metabolism: a reappraisal of older and recent concepts.</a> Respir. Physiol. 118, 103-115 (1999).</li><li>Franchini, E., Bertuzzi, R. C. D., Degaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+Expenditure+in+Different+Judo+Throwing+Techniques.+Proceedings+of+first+joint+international+pre-Olympic+conference+of+sports+science+and+sports+engineering,+vol+II.">Energy Expenditure in Different Judo Throwing Techniques. Proceedings of first joint international pre-Olympic conference of sports science and sports engineering, vol II.</a> Bio-mechanics and sports engineering. , 55-60 (2008).</li><li>Calmet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+ecological+research+in+judo.">Developing ecological research in judo.</a> Percept. Mot. Skills. 105, 646-648 (2007).</li><li>Mello, F. D., Bertuzzi, R. C., Grangeiro, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+systems+contributions+in+2,000+m+race+simulation:+a+comparison+among+rowing+ergometers+and+water.">Energy systems contributions in 2,000 m race simulation: a comparison among rowing ergometers and water.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 105, 615-619 (2009).</li><li>Bertuzzi, R. C., Franchini, E., Ugrinowitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+MAOD+using+only+a+supramaximal+exhaustive+test.">Predicting MAOD using only a supramaximal exhaustive test.</a> Int. J. Sports Med. 31, 477-481 (2010).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi per quanto riguarda questo studio.

Il metodo abbiamo dimostrato lepre può essere utilizzato sia per l&#39;esercizio continuo e intermittente. Il grande vantaggio del metodo è che può essere adattato per esercizi e sportivi che sono difficili da imitato in ambienti di laboratorio controllate. Inoltre, questo è l&#39;unico metodo disponibile in grado di distinguere il contributo dei tre sistemi energetici diversi. Pertanto, il metodo consente lo studio di sport con grande somiglianza a situazioni reali, fornendo desiderabile validità ecologica allo studio 9. Per esempio, un recente studio di Mello et al. Dieci hanno mostrato che il contributo glicolitico in un m 2000 sulla razza acqua canottaggio è di solo il 7%, il che significa che le prestazioni voga è prevalentemente a carico del metabolismo aerobico. Allo stesso modo, uno studio di Beneke et al 4 confermato che la principale fonte di energia durante uno dei test più utilizzati anaerobici, il test Wingate anaerobica, è il metabolismo anaerobico (20% aerobico;. Del 30% alaCTIC glicolitico e 50%). Recenti studi da parte del nostro gruppo hanno caratterizzato anche gli apporti energetici di arrampicata indoor judo 6 e 8, come riportato in questo esempio. Infatti, la conoscenza l&#39;apporto energetico è fondamentale per lo sviluppo di strategie ergogenici, organizzazione di formazione o anche per la convalida di un test. Questo metodo ha alcune limitazioni. In primo luogo, il costo delle attrezzature è piuttosto elevata, e personale specializzato addestrato sono richiesti. In secondo luogo, sebbene la maggior parte sport possono essere simulati con questa tecnica, non è un qualsiasi tipo di esercizio che può essere studiata utilizzando l&#39;analizzatore di gas portatile. Infine, come lattato plasmatico non esattamente rappresenta il lattato totale prodotta dal muscolo scheletrico durante l&#39;attività, i risultati ottenuti con tale procedura può essere considerato come un estimativa del fabbisogno metabolico durante l&#39;esercizio, piuttosto che una precisa quantificazione del contributo energetico. Tuttavia, questo è l&#39;unico validato meThOD disponibile 11 in grado di distinguere il contributo dei tre sistemi energetici diversi.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reattivo </th><th> Azienda </th><th> Comments </th></tr><tr><td> YSI 1500 Sport </td><td> Yellow Springs </td><td> Questa apparecchiatura consente una rapida e facile determinazione plasmatica del lattato </td></tr><tr><td> K4 b2 </td><td> Cosmed </td><td> Questa apparecchiatura è indispensabile per la misurazione del consumo di ossigeno durante l&#39;esercizio </td></tr><tr><td> Software MicroCal 6,0 </td><td> Origine </td><td> Questo software (o qualsiasi altro con caratteristiche simili) sarà utile per i calcoli </td></tr></tbody></table>

determining the contribution of the energy systems during exercise

Uno degli aspetti più importanti della richiesta metabolica è il contributo relativo dei sistemi energetici per l&#39;energia totale necessaria per una data attività fisica. Anche se alcuni sport sono relativamente facili da riprodurre in laboratorio (per esempio, corsa e ciclismo), una serie di sport sono molto più difficili da riprodurre e studiato in situazioni controllate. Questo metodo presenta come valutare il contributo differenziale dei sistemi energetici in sport che sono difficile imitare in condizioni controllate di laboratorio. I concetti qui illustrati possono essere adattati a qualsiasi sport. Le seguenti variabili fisiologiche saranno necessari: resto il consumo di ossigeno, consumo di ossigeno esercizio, dopo l&#39;esercizio fisico il consumo di ossigeno, la concentrazione plasmatica di lattato di riposo e post-esercizio picco di lattato plasma. Per calcolare il contributo del metabolismo aerobico, è necessario il consumo di ossigeno a riposo e durante l&#39;esercizio. Utilizzando l&#39;metodo trapezoidale, calcolare l&#39;area sotto la curva di consumo di ossigeno durante l&#39;esercizio, sottraendo la zona corrispondente al consumo di ossigeno resto. Per calcolare il contributo del metabolismo anaerobico alactic, il post-esercizio curva di consumo di ossigeno deve essere regolata ad un mono o bi-esponenziale modello (scelto da quello che meglio si adatta). Quindi, utilizzare i termini di equazione adattata per calcolare il metabolismo anaerobico alactic, come segue: ATP-CP metabolismo = A 1 (mL s -1.) Xt 1 (s). Infine, per calcolare il contributo del sistema lattico anaerobico, moltiplicare lattato plasmatico di picco 3 e dalla massa corpo dell&#39;atleta (il risultato di mL viene poi convertito in L e in kJ). Il metodo può essere usato per esercizio sia continua e intermittente. Questo è un approccio interessante in quanto può essere adattato per esercizi e sportivi che sono difficili da imitato in ambienti controllati. Inoltre, questo è il solovailable metodo in grado di distinguere il contributo dei tre sistemi energetici diversi. Pertanto, il metodo consente lo studio di sport con grande somiglianza a situazioni reali, fornendo desiderabile validità ecologica allo studio.

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Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Questo protocollo permette di ricercatori si sono concentrati su attività fisica e scienze dello sport per determinare il contributo relativo dei tre sistemi energetici diversi alla spesa totale di energia nel corso di una grande varietà di esercizi.

Determinare il contributo dei sistemi di energia durante l&#39;allenamento

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

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Research

JoVE Journal

Biology

41.2K Views.  University of Sao Paulo. Questo protocollo permette di ricercatori si sono concentrati su attività fisica e scienze dello sport per determinare il contributo relativo dei tre sistemi energetici diversi alla spesa totale di energia nel corso di una grande varietà di esercizi.

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Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

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Ricerca

Biologia

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

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Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

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Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Determinazione del numero delle cellule durante coltura cellulare utilizzando il contatore di cellule Scettro

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Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Espianti blastomero al test per l&#39;Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

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Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

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The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

L&#39;uso di chemostati in Biologia microbica Sistemi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

Health monitoring systems are developed and used in zebrafish research facilities because pathogens of Danio rerio such as Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa have the potential to impair animal welfare and research. The fish are typically analyzed post mortem to detect microbes. The use of sentinels is a suggested way to improve the sensitivity of the surveillance and to reduce the number of animals to sample. The setting of a pre-filtration sentinel tank out of a recirculating system is described. The technique is developed to prevent water pollution and to represent the fish population by a careful selection of age, gender, and strains. In order to use the minimum number of animals, techniques to screen the environment are also detailed. Polymerase Chain Reaction (PCR) on surface sump swabs is used to significantly improve the detection of some prevalent and pathogenic mycobacterial species such as Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilum, and Mycobacterium chelonae. Another environmental method consists of processing the sludge at the bottom of a holding tank or sump to look for P. tomentosa eggs. This is a cheap and fast technique that can be applied in quarantine where a breeding device is submerged into the holding tank of imported animals. Finally, PCR is applied to the sludge sample and A. hydrophila is detected at the sump&#39;s bottom and surface. Generally, these environmental screening techniques applied to these specific pathogens have led to an increased sensitivity compared to the testing of pre-filtration sentinels.

Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

This protocol describes the use of sump swabs and sludge analysis of zebrafish systems, which leads to increased detection compared to the sole use of sentinels to detect pathogens such as Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa. A system to monitor P. tomentosa eggs in quarantine is also proposed.

Selezione ambientale di hydrophila dell'aeromonas, Mycobacterium spp. e Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish sistemi

Health monitoring systems are developed and used in zebrafish research facilities because pathogens of Danio rerio such as Aeromonas hydrophila, ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Istituzione di un pH extracellulare acido sistema cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...