Questo protocollo è significativo perché è progettato per rispondere a domande sulla struttura correlata alla funzione della valvola polmonare murina, che è generalmente complicata a causa della sua eterogeneità intrinseca. La fissazione controllata e l'imaging correlativo sono stati utilizzati per catturare la struttura su più scale di lunghezza. Le immagini locali ad alta risoluzione possono quindi essere mappate nella posizione anatomica precisa sulla valvola polmonare.
A dimostrare la procedura sarà il Dr.Tai Yi, direttore della microchirurgia presso il Centro di Medicina Rigenerativa del Nationwide Children's Hospital. Inizia con l'autoclave degli strumenti necessari per la dissezione del mouse, tra cui forbici fini, microforze, morsetti microvascolari, pinze per l'applicazione di morsetti, portaasele, forbici a molla e riavvolgitori. Dopo l'eutanasia di un topo adulto C57BL/6, metterlo in una posizione reclinata dorsale su un vassoio, fissare gli arti con del nastro adesivo ed eseguire la toracotomia.
Esporre il cuore rimuovendo il tessuto adiposo e la fascia in eccesso, quindi rimuovere l'atrio destro e perfondere il ventricolo sinistro con soluzione salina a temperatura ambiente. Rimuovere l'intero cuore tagliando la vena cava superiore, la vena cava inferiore, l'arteria polmonare e l'aorta e tagliare circa due millimetri sopra la giunzione ventricoloatriale, che fungerà da condotto per la pressurizzazione. Rimuovere i ventricoli sinistro e destro per esporre le camere alla pressione atmosferica, assicurando che la struttura del tronco polmonare non sia influenzata rimuovendo i ventricoli.
Tubo di pressurizzazione dell'anastomosi con l'arteria polmonare, lasciando circa un millimetro di distanza tra la giunzione sinotubulare e l'estremità del tubo per accogliere grandi movimenti delle foglioline e del tronco polmonare. Elevare il serbatoio a una pressione fisiologica analoga e riempirlo con la soluzione salina. Testare il sistema di flusso per assicurarsi che non vi siano blocchi o bolle d'aria.
Collegare un rubinetto alla valvola polmonare anastomosizzata e garantire un flusso adeguato attraverso il tubo commutando il tratto di deflusso. Una volta che il flusso è sufficiente, spostare il deflusso verso la valvola polmonare anastomosizzata e garantire la pressurizzazione del tronco polmonare identificato dalla distensione del tronco. Dopo aver confermato la pressurizzazione del tronco polmonare, incorporare gradualmente la soluzione fissativa primaria fino a quando il 25% della capacità del serbatoio della soluzione salina viene spurgato.
Posizionare una garza imbevuta di fissativo sul campione di tessuto per evitare l'essiccazione. Perfondere il fissativo per tre ore, riempiendo il serbatoio per mantenere una pressione costante. Dopo la perfusione, conservare la valvola cardiaca nella soluzione fissativa a quattro gradi Celsius fino all'uso per un massimo di una settimana.
Per la colorazione, lavare il campione di valvola cardiaca fissa tre volte con tampone di cacodilato molare freddo da 0,15 molari per cinque minuti e immergere completamente la valvola cardiaca in una soluzione di 1,5 ferrocianuro di potassio, 0,15 cacodilato molare, due cloruro di calcio millimolare e tetroxuro di osmio al 2% su ghiaccio per un'ora. Lavare i campioni con acqua doppia distillata a temperatura ambiente mettendoli in un tubo per cinque minuti con leggera agitazione. Dopo altri tre lavaggi, posizionare il campione in soluzione filtrata di tiocarboidrazide a temperatura ambiente.
Dopo 20 minuti, lavare il campione tre volte con acqua come dimostrato in precedenza. Quindi, posizionare il campione in teossido di osmio al 2% a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, lavarlo con acqua tre volte per cinque minuti ciascuno e incubare il campione in acetato di uranile all'1% durante la notte a quattro gradi Celsius.
Nel frattempo, preparare una soluzione di nitrato di piombo. Il giorno seguente, eseguire la fase di lavaggio tre volte come dimostrato in precedenza, quindi incubare il tessuto della valvola cardiaca in soluzione di aspartato di piombo a 60 gradi Celsius per 30 minuti. Lavare i campioni altre tre volte, quindi eseguire un trattamento di disidratazione seriale sui tessuti della valvola cardiaca con etanolo al 20, 50, 70 e 90% appena preparato su ghiaccio per cinque minuti ciascuno, seguito da due trattamenti successivi con etanolo al 100%.
Dopo la disidratazione, spostare i tessuti in acetone ghiacciato, quindi metterlo in acetone fresco a temperatura ambiente per 10 minuti. Per l'incorporamento, realizzare la miscela di resina secondo le specifiche del produttore. Posizionare i tessuti nei successivi trattamenti da 25 a 75, da 50 a 50 e da 75 a 25 resina a miscela di acetone per due ore ciascuno.
Infine, posizionare i tessuti in resina al 100% durante la notte. Il giorno seguente, mettere i tessuti in resina fresca al 100%. Dopo due ore, trasferire i tessuti in una capsula incorporante, aggiungere resina fresca al 100% e metterla in un forno a 60 gradi Celsius per 48 ore per polimerizzare.
L'arteria polmonare anastomosa asportata prima e dopo l'applicazione della pressione idrostatica è mostrata qui. Il tronco polmonare si distende radialmente indicando che i lembi della valvola polmonare sono in una configurazione chiusa. La tomografia microinciuta ha confermato la conferma della valvola polmonare.
I foglietti sono stati chiusi e l'anulus era circolare, mentre sono stati osservati vari gradi di pressurizzazione inadeguata della valvola polmonare mediante fissazione o collasso arterioso. Il volume micro CT che rende le sezioni trasversali virtuali è stato correlato con immagini ottiche per confermare la direzione e la posizione di slicing. Le immagini SBF SEM ad alta risoluzione sono state scattate in una regione locale all'interno di un volantino quando il blocco del campione si trovava nella posizione e nell'orientamento desiderati.
Le immagini correlate tra il volume micro CT che esegue il rendering di immagini virtuali slice, a bassa risoluzione e SBF SEM ad alta risoluzione sono mostrate qui. Nella rappresentazione 3D di una regione segmentata della valvola polmonare, possono essere identificati componenti extracellulari come cellule endoteliali, cellule interstiziali valvolari e fibre extracellulari. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che l'esecuzione della pressurizzazione è fondamentale e garantirà che la resa sia la più alta possibile.
