La citometria a flusso è una tecnica potente che consente l'analisi multiparametrica di singole cellule. Può identificare i biomarcatori dell'apoptosi precoce e tardiva in modo accurato e rapido analizzando milioni di cellule. Più molecole cellulari vengono colorate e rilevate simultaneamente.
In particolare, la citometria a flusso da banco consente l'analisi e l'interpretazione da parte di citometristi a flusso non esperti. A dimostrare la procedura sarà Esther Zhou, una studentessa post-laurea del gruppo di cancro della vitamina D. Inizia coltivando le colture cellulari in un ambiente di CO2 umidificata a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2.
Assicurarsi che la coltura cellulare sia circa il 70% confluente nel pallone genitore prima di passare le cellule per gli esperimenti. Rimuovere il mezzo dal pallone e lavare le celle con 1X PBS. Quindi aggiungere un millilitro di tripsina per staccare le cellule.
Dopo che le cellule iniziano a staccarsi, neutralizzare la tripsina aggiungendo circa cinque millilitri di terreno di coltura fresco integrato con il 10% di siero fetale di vitello prima di contare le cellule. Cellule di seme a 15.000 cellule per millilitro in tre millilitri di terreno di coltura cellulare in una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti. Incubare le piastre di coltura durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 per consentire l'attacco delle cellule al fondo del pozzo.
Il giorno successivo, trattare le colture sperimentali con 100 nanogrammi per millilitro di actinomicina D e i controlli del mezzo e del solvente con terreno di coltura fresco e DMSO, rispettivamente, per 24 ore. Rimuovere il mezzo dai pozzetti e raccogliere il mezzo esaurito in un tubo da 15 millilitri. Lavare le celle con 1X PBS.
Aggiungere 500 microlitri di tripsina per staccare le cellule. Pipettare delicatamente un millilitro di mezzo due o tre volte per rimuovere meccanicamente le cellule rimanenti ancora attaccate al fondo del pozzetto. Aggiungere la soluzione dai pozzetti in un tubo da 15 millilitri e quindi aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura fresco per neutralizzare la tripsina.
Pipettare 450 microlitri di reagente contenente coloranti leganti il DNA in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 50 microlitri della sospensione cellulare al tubo della microcentrifuga. Incubare il tubo a temperatura ambiente per cinque minuti.
Enumerare le cellule mediante citometria a flusso. Diluire tutti i campioni ad una concentrazione di una volta 10 alla sesta cellula per millilitro con terreno di coltura cellulare prima di procedere ai saggi di apoptosi. Per rilevare l'esternalizzazione della fosfatidilserina utilizzando un'annessina V, aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga.
A ciò, aggiungere 100 microlitri di una miscela 1: 1 di annessina V coniugata fluorescente e reagente 7-AAD. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti, al riparo dalla luce. Per l'analisi della depolarizzazione della membrana mitocondriale, iniziare centrifugando 100 microlitri della sospensione cellulare a 300 volte G per cinque minuti e quindi scartare il surnatante.
Risospendere le cellule in un millilitro di 1X PBS. Aggiungere 100 microlitri di soluzione colorante TMRE a ciascun campione e mescolare la sospensione mediante back-pipettaggio delicato. Avvolgere i campioni in un foglio di alluminio pulito per proteggerli dalla luce e incubare le celle per 20 minuti in un ambiente umidificato di CO2 a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, aggiungere la soluzione di lavoro 7-AAD al campione e miscelarla. Per rilevare le caspasi-3 e 7 terminali attivate, iniziare diluendo il peptide legante il DNA legato a DEVE in DMSO in un rapporto di 1: 8 con PBS 1X sterile per rendere la soluzione di rilevamento della caspasi funzionante. Conservare la soluzione su ghiaccio o aggiungere da due a otto gradi Celsius, al riparo dalla luce.
Aggiungere due microlitri di una soluzione madre 7-AAD a 148 microlitri di 1X PBS per rendere la soluzione di lavoro 7-AAD. Conservare la soluzione su ghiaccio o da due a otto gradi Celsius, al riparo dalla luce. Centrifugare 50 microlitri della sospensione cellulare per cinque minuti a 300 volte G e scartare il surnatante.
Risospendere le cellule in 50 microlitri di 1X PBS, seguiti da cinque microlitri della soluzione di lavoro di rilevamento della caspasi e mescolare accuratamente. Allentare il tappo dei tubi e incubare per 30 minuti in un ambiente CO2 umidificato a 37 gradi Celsius, al riparo dalla luce. Aggiungere 150 microlitri della soluzione di lavoro 7-AAD a ciascun campione e mescolare.
Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Per rilevare rotture del DNA a doppio filamento e danni totali al DNA, centrifugare prima 50 microlitri della sospensione cellulare per cinque minuti a 300 volte G e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 500 microlitri di 1X PBS e aggiungere 500 microlitri di un tampone di fissazione a base di formaldeide e miscelare.
Incubare i campioni su ghiaccio per 10 minuti. Centrifugare per cinque minuti a 300 volte G ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 90 microlitri di 1X PBS in una provetta da microcentrifuga.
Aggiungere 10 microlitri della soluzione anticorpale alla provetta della microcentrifuga. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Aggiungere 100 microlitri di 1X PBS e centrifugare per cinque minuti a 300 volte G.Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 200 microlitri di 1X PBS.
Mescolare il campione mediante back-pipettaggio delicato prima di caricare il campione sul citometro a flusso. Verificare le prestazioni analitiche del citometro a flusso eseguendo il kit di controllo del sistema dello strumento e non procedere con l'esecuzione dei campioni fino a quando tutti i controlli non sono stati completati e superati. Innanzitutto, caricare un campione di controllo negativo sul citometro a flusso e selezionare Esegui, Regola impostazioni, in modo che lo strumento inizi ad aspirare il campione e fornisca un'anteprima in tempo reale degli eventi rilevati.
Utilizzando l'anteprima dal vivo, regolare le soglie per la fluorescenza e le dimensioni delle celle. Disegna un cancello rettangolare attorno alla popolazione cellulare, trascina l'indicatore di soglia per escludere i detriti cellulari e seleziona Avanti, Imposta profilo di apoptosi per procedere. Tocca e trascina i marcatori del quadrante per separare le popolazioni di celle e tracciare gli eventi rilevati in tempo reale.
Utilizzare questi grafici per guidare l'utente finale sul posizionamento appropriato dei marcatori del quadrante. Selezionare Avanti, Verifica impostazioni per procedere in modo che lo strumento visualizzi un riepilogo delle impostazioni. Dopo aver esaminato le impostazioni, seleziona Avanti, Fine impostazioni per applicare queste impostazioni a tutti gli esempi all'interno dell'esperimento.
Mescolare il primo campione mediante backpipettaggio delicato e caricare il primo campione sul citometro a flusso. Selezionare Avanti, quindi assegnare un nome all'esempio e selezionare Esegui in modo che il sistema inizi a eseguire l'esempio. Se necessario, eseguire la messa a punto dei gate o dei marcatori di quadrante dopo l'acquisizione.
Individua l'esperimento che deve essere modificato navigando nel browser di file del sistema e aprilo. Tocca l'anteprima in miniatura della trama per ingrandirla. Per regolare i marcatori quadrante, fate clic sull'intersezione delle linee verticali e orizzontali per spostare gli indicatori così come sono, quindi regolate l'angolo di una delle due linee facendo clic sulla linea e trascinando la maniglia.
Per perfezionare il gating della cella, fare clic sulla scheda Gate e regolare le dimensioni del gate. Regola i marcatori come desideri e applica queste impostazioni a tutti gli esempi dell'esperimento selezionando l'icona del segno di spunta, contrassegnando tutti gli esempi e selezionando Accetta. Eseguire test in triplice copia ed eseguire un'analisi della varianza con un test Bonferroni post hoc per valutare le differenze significative tra i campioni e i controlli.
Il conteggio delle cellule e i risultati di vitalità hanno mostrato che il 95,2% delle cellule del campione erano vive e il 4,8% erano morte. La concentrazione cellulare è risultata essere 5,90 volte 105 cellule per millilitro. Il test di annexina V e morte cellulare ha mostrato un aumento significativo delle cellule apoptotiche nelle cellule SiHa trattate con 100 nanogrammi per millilitro di actinomicina D, rispetto ai controlli.
Il test del potenziale transmembrana elettrochimico mitocondriale ha dimostrato una significativa diminuzione dei profili di salute cellulare tra actinomicina-D, controllo del mezzo e controllo del solvente, che ha suggerito che 100 nanogrammi per millilitro di actinomicina D hanno indotto la depolarizzazione mitocondriale nelle cellule SiHa. Il test caspasi-3 e 7 ha dimostrato una significativa attivazione delle caspasi terminali nelle cellule di SiHa trattate con 100 nanogrammi per millilitro di actinomicina D, rispetto ai controlli. L'actinomicina D ha indotto significativamente marcatori di danno al DNA, ATM e H2A.
X nelle cellule SiHa, che ha suggerito un aumento significativo del danno al DNA. Per migliorare la precisione, assicurarsi di raccogliere la popolazione cellulare totale. Inoltre, rispettare le concentrazioni cellulari raccomandate dal produttore e i tempi di colorazione.
La protezione dei campioni macchiati dalla luce evita il fotosbiancamento o i fluorofori. L'analisi biochimica dell'apoptosi mediante citometria a flusso deve essere supportata dalla microscopia. Questo identificherà le caratteristiche morfologiche dell'apoptosi classica.
Le caratteristiche includono condensazione nucleare, miscelazione della membrana cellulare, corpi apoptotici e carrioressi.
