Gli isolamenti di popolazioni autentiche di cellule di inversione apoptotica sono stati un problema in precedenza, il che limita notevolmente la nostra comprensione delle conseguenze dell'inversione dell'apoptosi. Questo protocollo ci permette di generare popolazioni più pure di cellule di inversione apoptotica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i materiali e le attrezzature utilizzati sono ampiamente disponibili in diverse istituzioni.
Questa tecnica è facilmente applicabile per isolare una popolazione più pura di cellule che hanno subito l'inversione dell'apoptosi. Come riportato in precedenza, le cellule normali possono anche subire l'inversione dell'apoptosi, che oltre alle cellule tumorali del seno, possono essere avviate diverse cellule chemio, così come le cellule normali, e possono essere utilizzati i vari stimoli apoptotici. Poiché la cella di inversione ha attraversato l'apoptosi e lo smistamento rapido, il tasso di recupero è solitamente basso.
Un numero di cella iniziale più grande è ricombinante per aumentare la resa finale. Per iniziare, impostazioni cultura MCF-7, MDA-MB-231, Per iniziare, impostazioni cultura MCF-7, MDA-MB-231 e celle T47D, secondo il protocollo di testo. Successivamente, lavare le celle con PBS due volte, quindi aggiungere due millilitri dello 0,05% di tripside-EDTA dello 0,05% di tripside-EDTA all'MCF-7, e celle MDA-MB-231, alle celle MCF-7, MDA-MB-231, e due millilitri dello 0,25% di tripside-EDTA e due millilitri dello 0,25% di tripsiderina-EDTA alle celle T47D.
alle cellule T47D. Coltura delle cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius, in un incubatore di coltura cellulare al 5% di anidride carbonica. Mentre le cellule incubano, controllare il distacco delle cellule con un microscopio per prevenire la sovragestione mediante tripside-EDTA.
Quando più del 90% delle celle si stacca, aggiungere cinque millilitri di mezzo RPMI completato al piatto e pipettarlo più volte sulla superficie dello strato cellulare. Quindi, trasferire le cellule in tubi conici da 15 millilitri e centrifuga. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo i pellet con tampone FACS in tubi di micro-centrifuga da 1,5 millilitri.
Quindi, dividere le cellule in diversi tubi. Centrifuga i tubi ancora una volta e scarta il supernatante. Aggiungere quindi il blocco Fc diluito ai campioni.
Incubare i campioni sul ghiaccio al buio per 20 minuti, prima di centrifugare nuovamente i campioni. Dopo questo, scartare il supernatante. Successivamente, aggiungere anticorpi monoclonali coniugati al fluorocromo contro cd44 umano, e CD24, contro CD44 umano, e CD24, in uno a 40, e da una a 10 diluizioni, rispettivamente, ai gruppi a doppia colorazione.
Per i controlli positivi, aggiungere anticorpi CD44 Per i controlli positivi, aggiungere anticorpi CD44 alle cellule MDA-MB-231, alle cellule MDA-MB-231 e anticorpi CD24 alle cellule MCF-7 e anticorpi CD24 alle cellule MCF-7 in una o 40 e da una a 10 diluizioni, rispettivamente. Aggiungere PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, Add PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, diluito con un rapporto uno-40 alle cellule come controllo isotopico per gli anticorpi CD44. Quindi, aggiungere PE Mouse IgG2a Kappa, Quindi, aggiungere PE Mouse IgG2a Kappa, diluito con un rapporto uno a 10 alle cellule come controllo isotopico per gli anticorpi CD24.
Incubare i campioni a quattro gradi Celsius al buio per 30 minuti. Quindi, centrifugare i campioni a 300 g Then, centrifugare i campioni a 300 g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e lavare il pellet due volte in 500 micro litri di PBS.
Quindi, ripetere la centrifugazione come descritto in precedenza. Sospendere di nuovo il pellet su 0,5 millilitri di PBS e filtrare le sospensioni attraverso una rete di nylon da 40 micrometri. Quindi, eseguire la sospensione attraverso uno smistatore di celle attivato dalla fluorescenza.
Raccogliere le celle con marcatori positivi CD44 negativi e CD24 in tubi a fondo tondo contenenti un millilitro di mezzo di raccolta. Quindi, centrifuga i tubi e scarta il supernatante. Successivamente, placcare le cellule tumorali non staminali del seno ordinate in un piatto di coltura contenente un mezzo di raccolta fresco per un'ulteriore coltura.
In primo luogo, utilizzare una staurosporina millimolare in DMSO, Per preparare 2,5 micromolari staurosporina in mezzo, secondo il protocollo di testo. Quindi, rimuovere il supporto di coltura dalle celle. Lavare le cellule con due millilitri di PBS una volta, dopo questo, aggiungere 10 millilitri del mezzo di staurosporina alle cellule MSF-7 per sei ore, per indurre l'apoptosi, quando le cellule sono confluenti al 70%.
Quindi, preparare un paclitaxel millimolare in DMSO. Quindi, aggiungere 12,5 micro litri Quindi, aggiungere 12,5 micro litri del paclitaxel millimolare 1 millimolare al mezzo completato delle cellule T47D per creare un volume finale di 10 millilitri in un tubo conico da 15 millilitri. Rimuovere il mezzo di coltura dalle cellule e lavare le cellule con 2 millilitri di PBS.
Quindi, aggiungere il mezzo paclitaxel alle cellule per 10 ore per indurre l'apoptosi per 10 ore per indurre l'apoptosi quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza. Successivamente, rimuovere il supporto dal gruppo MCF-7 trattato con solvente e lavarlo con due millilitri di PBS. Quindi, aggiungere 10 millilitri dello 0,25% di mezzo DMSO Quindi, aggiungere 10 millilitri dello 0,25% di mezzo DMSO per sei ore come controllo del solvente per la staurosporina.
Rimuovere il mezzo di coltura dal gruppo T47D trattato con solvente e lavare le cellule con due millilitri di PBS. Quindi, aggiungere 10 millilitri dello 0,05% di mezzo DMSO Quindi, aggiungere 10 millilitri dello 0,05% di mezzo DMSO per 10 ore come controllo del solvente per il paclitaxel. Successivamente, macchiare la cellula e incubarli per 20 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al cinque%.
Utilizzare un microscopio a scansione laser confocale 60 volte per osservare i cambiamenti morfologici delle cellule trattate. Macchiare sia l'induttore apoptotico che le cellule MCF-7 e T47D trattate con solvente e le cellule MCF-7 e T47D trattate con solvente al buio per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al cinque%. Utilizzando lo smistatore di celle attivato dalla fluorescenza, raccogliere le cellule positive dai gruppi trattati dall'induttore in tubi inferiori rotondi contenenti un millilitro di mezzo di raccolta.
Quindi, centrifuga i tubi come descritto in precedenza e scarta il supernatante. Raccogliere le cellule negative dai gruppi trattati con solvente in tubi a fondo tondo con un millilitro di mezzo di raccolta. Centrifugare i tubi e scartare il supernatante.
Successivamente, sospendere di nuovo le celle ordinate in un nuovo supporto di raccolta. Seminare le cellule in piastre di coltura tissutale a 12 pozzi e culturerle per sette giorni per l'inversione dell'apoptosi. Raccogliere l'MCF-7 invertito sia in gruppi induttori che trattati con solvente con 0,05% di tripside-EDTA.
con lo 0,05% di tripside-EDTA. Quindi, raccogliere le cellule T47D in entrambi gli induttori Quindi, raccogliere le cellule T47D in gruppi sia induttori che trattati con solvente con 0,25% di tripside-EDTA. Macchiare le cellule con anticorpi monoclonali coniugati al fluorocromo contro CD44 e CD24 umani.
Durante la macchia delle celle, preparare i controlli isotipo come illustrato in precedenza. Infine, eseguire le celle su un citometro di flusso e rilevare la percentuale di celle con marcatori positivi CD44 e CD24 negativi. In questo protocollo è stata osservata la transizione dalle cellule tumorali non staminali al seno alle cellule simili al CSC mammario.
L'isolamento delle cellule tumorali non staminali è stato effettuato per la prima volta nelle cellule MCF-7. I tipici cambiamenti morfologici sono stati osservati dopo l'aggiunta di induttori apoptotici e le cellule recuperate dall'apoptosi con morfologia simile dopo il ritiro del farmaco. Le cellule attivate dal caspace sono state etichettate e smistate in base alla loro intensità di fluorescenza più elevata rispetto alle cellule senza attivazione dello spazio.
Durante il processo di induzione apoptotica, il solvente è stato utilizzato per escludere la possibilità che la procedura dei fatti, o il solvente stesso, fosse la causa della transizione. Le cellule attivate da Caspace nei gruppi di trattamento apoptotico-induttore sono state trovate come nexin cinque positive e PI negative, suggerendo che fossero cellule apoptotiche. Le cellule apoptotiche sono state raccolte e coltivate per il recupero, rispetto ai gruppi trattati con solventi, l'analisi citometrica del flusso ha mostrato che c'erano cellule che apparivano nel quadrante positivo CD44 e CD24 negativo nella popolazione invertita originariamente non stem di cellule tumorali.
Il gaging è importante nell'analisi del flusso e nello smistamento delle celle, che nei laboratori dovrebbe essere preparato un controllo sufficiente. Poiché questa procedura di inversione dell'apoptosi in vitro isola le cellule tumorali apoptotiche pure, esperimenti come le risorse di tumorigenesi in vivo possono essere condotti per comprendere le conseguenze del reale inverso delle cellule. Questa tecnica fa luce sulla causa della ricaduta del cancro, quindi può essere studiata per prevenire potenzialmente il ri-verificarsi nei pazienti oncologici.
Ricorda di proteggerti correttamente quando conduci esperimenti di coltura cellulare secondo le normative di livello biosafe del tuo istituto.
