Questo protocollo evidenzia l'importanza del microambiente tumorale nell'attivazione dei fibroblasti associati al cancro o CAF. Potrebbe essere un ottimo modello in vitro per studiare le caratteristiche fenotipiche. I principali vincoli nella biologia della CAF risiedono nella limitata disponibilità di CAF da campioni primari di biopsia tumorale.
Quindi questa tecnica può essere utilizzata per studiare vari aspetti della biologia CAF. Questo studio descrive la produzione crociata aberrante e la disfunzione mitocondriale associata all'attivazione della CAF che porta a una prognosi tumorale sfavorevole. L'applicazione di questo metodo sarebbe utile per valutare le interazioni traumatiche del tumore, in particolare l'attivazione della CAF e la salute mitocondriale.
Al fine di esplorare i nuovi bersagli farmacologici. Gli individui devono avere esperienza nella procedura cellulare prima di eseguire questa tecnica. La dimostrazione visiva di questa tecnica permetterà di comprendere i passaggi critici nell'isolamento della popolazione CAF dagli sferoidi tumorali e le applicazioni a valle per studiare la biologia della CAF.
La signorina Leena Arora, la signorina Moyna Kalia e la signora Soumyajit Roy, assistenti del mio laboratorio, eseguono gli esperimenti. Per iniziare a crescere l'adenocarcinoma polmonare umano A549 e le cellule aderenti MRC-5 dei fibroblasti polmonari umani in cellule DMEM e monociti umani THP-1 in RPMI completano il terreno di crescita in palloni T25 a 37 gradi Celsius in una camera umidificata con il 5% di anidride carbonica.
Dopo tre giorni, alla confluenza cellulare dall'80 all'85%, lavare le cellule A549 e MRC-5 con un millilitro di PBS per un minuto. Successivamente, raccogliere le cellule incubandole con 500 microlitri di soluzione di tripsina EDTA allo 0,25% per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere immediatamente quattro millilitri di terreno di crescita completo per inattivare la tripsina.
Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e pellettarla a 125 x g per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un mezzo di crescita completo da cinque millilitri. Per stabilire sferoidi tumorali multicellulari, contare i numeri di cellule A549, MRC-5 e THP-1 utilizzando un contatore di cellule per un millilitro di volume.
Dopo il conteggio, preparare la sospensione cellulare in un rapporto di 5: 4: 1 e aumentare il volume a un millilitro con DMEM completo. Quindi, posizionare una goccia di 25 microlitri di miscela di sospensione cellulare sul coperchio di un piatto di coltura da 90 millimetri. Riempire il fondo del piatto con 10 millilitri di acqua sterile.
Capovolgere con attenzione il coperchio sopra la camera di idratazione piena d'acqua e posizionare il piatto in un incubatore di coltura cellulare per tre giorni. Il quarto giorno, monitorare gli sferoidi al microscopio. Per acquisire immagini, accendere l'interruttore di alimentazione.
Posiziona il piatto di coltura da 90 millimetri sul palco e seleziona l'ingrandimento 10x. Regolare le lenti ed esaminare le cellule per analizzare l'aggregazione e la proliferazione cellulare. Premere i pulsanti di blocco e salvataggio forniti per acquisire l'immagine.
Dopo l'imaging, sostituire il terreno di coltura aspirando con cura 20 microlitri di terreno da ciascuna goccia con un mezzo fresco. Per l'imaging live-dead, accendere Ctr advanced, che è switch one, quindi la CPU e attendere l'avvio del sistema software. Una volta avviato, posizionare il piatto da 90 millimetri contenente sferoidi sullo stadio del microscopio fluorescente invertito.
Quindi osservare e acquisire immagini con ingrandimento 10x selezionando l'opzione di fluorescenza nel software e selezionando il FITC per il canale calceina e Texas Red. Quindi, seleziona l'opzione, vivi e visualizza l'immagine. Regolare l'intensità della fluorescenza per un'ottimizzazione appropriata e fare clic sul pulsante sicuro.
Raccogliere 200 tumori, sferoidi ciascuno il settimo e il 10 giorno usando una pipetta da un millilitro e un tubo da 15 millilitri. Quindi pellettare gli sferoidi mediante centrifugazione a 125 x g per cinque minuti e aspirare accuratamente il surnatante. Lavare gli sferoidi con 200 microlitri di PBS, centrifugare nuovamente e scartare il surnatante.
Aggiungere 400 microlitri di soluzione EDTA di tripsina allo 0,25% per la disintegrazione degli sferoidi e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Eseguire un pipettaggio vigoroso per la completa disintegrazione degli sferoidi. Neutralizzare la tripsina aggiungendo un millilitro di terreno di crescita DMEM completo.
Quindi centrifugare la sospensione sferoidale e scartare il surnatante prima di risospendere il pellet in un millilitro di mezzo DMEM completo. Contare il numero totale di celle come dimostrato. Per l'isolamento dei fibroblasti associati al cancro o CAF dagli sferoidi tumorali, risospendere 1 x 10 alle cellule settima in 80 microlitri di selezione delle cellule attivate magneticamente a freddo o tampone MACS.
Aggiungere 20 microlitri di microsfere anti-fibroblasti nella sospensione cellulare, mescolare bene picchiettando delicatamente il tubo e incubandolo a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con un millilitro di tampone MACS freddo. Quindi centrifugare e aspirare il surnatante prima di risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone MACS.
Per la separazione delle cellule basata su sfere magnetiche, preparare la colonna MACS risciacquandola con tre millilitri di tampone MACS. Posizionare la sospensione cellulare nella colonna e raccogliere il flusso attraverso il contenimento della popolazione cellulare non etichettata. Quindi, lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone MACS prima di rimuoverla dal separatore.
Quindi posizionare la colonna sul tubo di raccolta. Raccogliere le cellule marcate con microsfere anti-fibroblasti aggiungendo cinque millilitri di tampone MACS e spingendo saldamente lo stantuffo nella colonna. Centrifugare le celle etichettate prima di procedere per le applicazioni a valle.
Contare il numero di CAF isolati e utilizzare circa 6 x 10 alle quarte cellule per l'analisi della citometria a flusso. Lavare le cellule una volta con PBS, quindi centrifugare e aspirare il surnatante. Quindi, aggiungere 100 microlitri di tampone di permeabilizzazione cellulare e incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 30 minuti con vortice intermittente per mantenere una sospensione a singola cella.
Ancora una volta, dopo la centrifugazione e la sospensione delle cellule nel tampone di permeabilizzazione, aggiungere due microlitri di anticorpo alfa SMA anti-umano coniugato APC e incubare a quattro gradi Celsius per 45 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di tampone di permeabilizzazione e centrifugare per rimuovere l'anticorpo in eccesso. Risospendere il pellet in 400 microlitri di tampone di permeabilizzazione per citometria a flusso.
Selezionare le cellule ACTA2 positive dopo aver distinto le popolazioni di cellule in base alla loro dispersione diretta e laterale. Selezione della popolazione di singoletto seguita dalla selezione delle cellule ACTA2 positive che appaiono come un singolo picco sull'istogramma a singolo parametro. Lo sviluppo di sferoidi tumorali multicellulari e l'analisi dei morti vivi sono mostrati qui.
Il settimo giorno, gli sferoidi erano compatti e rigidi con un diametro di circa 260 micron. Il giorno 10, gli sferoidi avevano un diametro di 480 micron. Nel test di vitalità cellulare, è stata osservata una diminuzione della fluorescenza dello ioduro di propidio e un aumento della fluorescenza della calceina-AM dal settimo al giorno 10.
La colorazione ipossica ha rivelato un nucleo ipossico al centro del giorno 10 sferoidi. Inoltre, è stata osservata una sovraregolazione dell'espressione genica E-caderina e Mki-67 con l'aumento dei giorni di formazione di sferoidi tumorali. I CAF isolati dagli sferoidi tumorali del giorno 10 erano circa il 69% positivi all'ACTA2.
I CAF hanno mostrato una sovraregolazione triplicata in ACTA2 e dieci volte nella catena del collagene di tipo 1 alfa 2 rispetto ai fibroblasti MRC-5. È stato osservato un aumento significativo dei livelli di ROS negli sferoidi tumorali del giorno 10 rispetto al settimo giorno, suggerendo il possibile coinvolgimento della generazione di ROS nell'attivazione della CAF. È stato osservato un aumento significativo dei livelli cellulari di ROS nei CAF, isolati dagli sferoidi tumorali del settimo e del giorno 10.
Inoltre, un'alterazione del potenziale della membrana mitocondriale è stata osservata dalla colorazione di JC-1. Un'induzione dell'espressione genica GLUT1 e MCT4 è stata osservata nei CAF rispetto ai fibroblasti normali. Nei CAF è stata osservata una significativa induzione della lattato deidrogenasi, della citocromo C ossidasi e dell'attività enzimatica della succinato deidrogenasi rispetto ai fibroblasti normali.
Un rapporto di 5: 4: 1 di cellule A549, MRC-5 e THP-1 deve essere utilizzato per lo sviluppo di successo dello sferoide tumorale multicellulare 3D. La popolazione di fibroblasti è fondamentale per la rigidità degli sferoidi tumorali. Simile alla soluzione cationica e alla caratterizzazione, si può anche usare questo sferoide tumorale per ottenere la popolazione di cellule macrofagiche associate al tumore, che è complice nella progressione del tumore.
Questa analisi sferoidale ci aiuterebbe a capire come le cellule cancerose incrociate dei fibroblasti sono coinvolte nell'attivazione dei CAF e può anche essere utilizzata per controllare i candidati farmaci specifici mitocondriali.
