L'obiettivo di questa procedura è valutare l'organizzazione e la dinamica dei microtubuli in vivo. I neuroni sono cellule polarizzate con compartimenti assonali, dendritici e sinaptici distinti, mantenuti dal loro citoscheletro sottostante. I microtubuli formano la maggior parte del citoscheletro neuronale e la dinamica e l'orientamento determinano eventi chiave durante lo sviluppo e la maturazione neuronale.
I microtubuli sono composti da eterodimeri alfa e beta tubulinica e sono intrinsecamente polarizzati con estremità più altamente dinamiche e estremità inferiori stabili. Durante la polimerizzazione alle estremità più, un complesso multimolerele di proteine leganti l'estremità, si associa transitoriamente ai protofilamenti e promuove l'assemblaggio di dimeri di tubulina. Questa tecnica ci aiuterà a visualizzare i microtubuli neurali in vivo.
Usando questa tecnica, si può determinare l'orientamento e altri parametri dei microtubuli dinamici durante lo sviluppo e la rigenerazione del neurone C.elegans. In genere usiamo questo reporter per visualizzare la dinamica dei microtubuli nel neurone sensoriale. Tuttavia, si può esprimere questo reporter in altri tipi di cellule come muscoli e pelle per visualizzare microtubuli dinamici in queste cellule.
Le proteine che legano le estremità etichettate fluorescentmente come EBP a GFP qui, appaiono come comete. La dinamica di queste comete è stata correlata con la crescita concomitante dei microtubuli e un indicatore chiave per misurare la dinamica e l'orientamento dei microtubuli. Per osservare queste comete in un tipo di cellula specifico, il transgene con DNA di EBP-2 e GFP è espresso sotto un promotore specifico.
Per l'espressione nei neuroni PLM, questo transgene è espresso sotto il make for promoter. Questi vermi transgenici possono essere visualizzati al microscopio stereo, con fluorescenza impostata prima dello smistamento o del montaggio. Per il montaggio dei worm per l'imaging delle comete EBP, realizziamo un Argos al 10% in un buffer M9.
e posizionare una goccia su un vetrino. Un'altra diapositiva viene utilizzata per premere la goccia in un film che si solidifica in un pad. Usiamo 0,1 micron, perline di polistirene come mezzo di montaggio, alcuni vermi vengono raccolti e ri-sospesi nella soluzione di perline.
Una scivolata di copertura viene bracconata per immobilizzare i vermi e presa per l'imaging. Quelli montati possono essere ripresi su qualsiasi microscopio a fluorescenza con una telecamera per l'imaging ad alta risoluzione. La configurazione è dotata di un'unità disco rotante per un'acquisizione più rapida e una riduzione dello sbiancamento fotografico e della fototossicità.
La diapositiva viene mantenuta sul palco e il campo dei vermi è focalizzato e centrato utilizzando l'illuminazione a campo luminoso. Un obiettivo a basso ingrandimento come 5X o 10X può essere utilizzato per questo scopo. I worm possono essere rimessi a fuoco con un obiettivo di ingrandimento elevato come 63X utilizzando la stessa illuminazione.
Questo obiettivo fornisce una risoluzione spaziale ottimale per l'imaging delle comete. Un centraggio fisso del neurone PLM viene eseguito sotto l'illuminazione a fluorescenza per prevenire l'eccessiva esposizione alla luce e lo sbiancamento fotografico del prum. Per l'acquisizione delle immagini utilizziamo software di invio fuori siti.
Utilizzando la configurazione di imaging dal vivo nel canale brightfield, focalizzamo la regione di coda del worm e la centriamo nel campo visivo. Questo è seguito dalla messa a fuoco del neurone PNM utilizzando la configurazione di imaging della luce con luce di eccitazione a 488 nanometri. Per un'acquisizione time-lapse, viene creata un'impostazione sperimentale in cui il tempo di esposizione, la durata del time lapse e l'intervallo tra i fotogrammi definiscono le abilità temporali dell'imaging.
Per le misurazioni quantitative alcuni filmati di comete EBP devono essere analizzati su Image J, che è un software open source. Il time-lapse acquisito si apre come un filone multi-immagine, che può essere visualizzato in anteprima come filmato. In questo particolare lasso di tempo, le comete possono essere viste nel corpo cellulare, nel processo anteriore e posteriore del neurone PLM.
Le comete che si allontanano dal corpo cellulare sono classificate come plus-end-out, e quelle che si muovono verso il corpo cellulare sono classificate come minus-end-out. Per iniziare l'analisi viene tracciata una linea segmentata sulla regione di interesse, che in questo caso è il processo interno del neurone PLM. Questo segmento di linea viene convertito in un kymograph utilizzando la funzione di reslice delle immagini.
Un kymograph è un'immagine temporale a distanza con pieghe diagonali che rappresentano le comete in movimento. Su queste tracce è possibile disegnare segmenti rettilinei e impostare parametri di misurazione utilizzando il menu analizza. Questi parametri possono essere convertiti in quantità e unità misurabili standard nel programma di analisi dei dati come Excel.
La larghezza della traccia corrisponde alla lunghezza di crescita. L'altezza rappresenta la durata della crescita e l'angolo della piega dà la direzione delle comete. Queste comete possono essere ulteriormente classificate in plus-end-out e minus-end-out, per trovare l'orientamento relativo dei microtubuli.
L'espressione transgenica di EBTA GFP può essere adattata per osservare la dinamica dei microtubuli in vari contesti cellulari, come la nuova rigenerazione. Per osservare la dinamica dei microtubuli negli assoni di valutazione della regione, l'assone viene ferito utilizzando un laser a femtosecondi, che può recise l'assone con precisione senza causare enormi danni collaterali. Dopo l'infortunio, i vermi possono essere recuperati su piastre del motore seminate per osservazioni successive.
I neuroni PLM mostrano una robusta rigenerazione esonero, che può essere osservata già sei ore dopo l'infortunio. Per prevenire la fototossicità per rigenerare nuovi diritti, l'imaging dal vivo viene eseguito in un microscopio a disco rotante. Le acquisizioni time-lapse degli assoni rigeneranti possono essere successivamente convertite in chimografi per l'analisi delle comete.
La durata della distanza e la direzione delle comete possono quindi essere interpretate in termini di orientamento e dinamica dei microtubuli. Il mio orientamento critico e le mie dinamiche sono determinanti chiave dei processi cellulari civili come la divisione cellulare, la migrazione e il mantenimento dell'architettura cellulare. Sebbene ci siano molti strumenti disponibili per la misurazione della dinamica dei microtubuli, la misurazione in vivo può essere impegnativa.
L'autofiorescenza, la fototossicità, l'artefatto di sovraespressione e le intensità variabili riportate sono alcune delle difficoltà incontrate durante l'osservazione dal vivo delle proteine leganti l'estremità, per valutare la dinamica dei microtubuli. Utilizzando un transgenico integrato con bassa concentrazione di DNA deportato e immagini a bassa illuminazione, questo studio ha affrontato metodi per mitigare alcune di queste sfide. I moduli di imaging e analisi qui descritti possono essere estesi ad altri reporter basati su microtubuli e al trasporto di proteine.
Questo non è applicabile solo ai neuroni C.elegance, ma può essere applicato ad altri tipi di cellule e sistemi modello.
