この手順の目的は、生体内の微小管組織とダイナミクスを評価することです。ニューロンは、軸索、樹状、シナプスコンパートメントを持つ偏光細胞であり、その根底にある細胞骨格によって維持されます。微小管はニューロン細胞骨格の大部分を形成し、ダイナミクスと向きは神経細胞の発達と成熟の間に主要な事象を決定する。
微小管は、アルファおよびベータチューブリンヘテロダイマーで構成され、本質的に非常にダイナミックなプラスエンドと安定したマイナスエンドで二極化しています。プラスエンドでの重合の間、エンド結合タンパク質の多分子複合体は、プロトフィラメントと一過性に関連付け、チューブリンダイマーの組み立てを促進する。この技術は、生体内の神経微小管を可視化するのに役立ちます。
この技術を使用して、C.elegansニューロンの発達および再生中に動的微小管の向きおよび他のパラメータを決定することができる。我々は通常、このレポーターを使用して、感覚ニューロンの微小管ダイナミクスを視覚化する。しかし、筋肉や皮膚などの他の細胞型でこのレポーターを発現させ、これらの細胞内の動的微小管を可視化することができます。
ここで蛍光標識されたエンド結合タンパク質は、ここでEBPをGFPにし、彗星として現れる。これらの彗星のダイナミクスは、微小管の併発成長と相関しており、微小管のダイナミクスと向きを測定するための重要な指標である。特定の細胞型でこれらの彗星を観察するために、EBP-2およびGFPのDNAを有するトランスジーンは、特定のプロモーター下で発現される。
PLMニューロンにおける発現に関しては、このトランスジーンはプロモーターのmakeの下で発現される。これらのトランスジェニックワームは、選別または取り付け前に蛍光を設定して、ステレオ顕微鏡で見ることができます。EBP彗星をイメージングするためのワームを取り付けるために、M9バッファに10%アルゴスを作ります。
とガラススライドにドロップを置きます。別のスライドは、パッドに固めるフィルムにドロップを押すために使用されます。我々は0.1ミクロン、ポリスチレンビーズを取り付け媒体として使用し、いくつかのワームが選ばれ、ビーズ溶液に再懸濁される。
カバースリップは、ワームを固定するために密猟され、イメージングのために撮影されます。取り付けられたものは、高解像度イメージングのためのカメラを使用して、任意の蛍光顕微鏡で画像化することができます。セットアップはより速く集録し、減らされた写真の漂白および光毒性のための回転ディスク装置が装備されている。
スライドはステージ上に保持され、ワームのフィールドは、明視野照明を使用して集中し、中央に配置されています。5Xや10Xのような低倍率の目的は、この目的のために使用することができます。同じ照明を使用して63Xのような高倍率の目的でワームを再集重することができます。
この目的は彗星のイメージ投射に最適な空間分解能を提供する。PLMニューロンの固定センタリングは、過度の光暴露とprumの写真の漂白を防ぐために蛍光照明の下で行われます。画像取得のために、我々はサイトからソフトウェアを送信を使用します。
明視野チャネルでライブイメージング構成を使用して、我々は、ワームの尾領域をフォーカスし、ビューフィールドにそれを中心にします。その後、488ナノメートルの励起光を用いた光イメージング構成を用いてPNMニューロンを集光する。タイムラプス獲得の場合、露光時間、時間経過時間、フレーム間の間隔がイメージングの時間的スキルを定義する実験的な設定を作成します。
定量測定では、EBP彗星の一部の映画をオープンソースソフトウェアであるイメージJで分析する必要があります。取得したタイムラプスは、映画としてプレビューできるマルチイメージストランドとして開きます。この特定のタイムラプスでは、彗星は、細胞体、前および後工程のPLMニューロンに見ることができる。
細胞体から離れる彗星はプラスエンドアウトに分類され、細胞体に向かって移動する彗星はマイナスエンドアウトに分類されます。分析を開始するには、セグメント化された線が対象領域(この場合はPLMニューロンの内部プロセス)に引かれます。この線分は画像の再スライス機能を使用して、キモグラフに変換されます。
キモグラフは移動する彗星を表す対角線折り目を持つ距離時間画像です。これらのトレースに直線セグメントを描画し、分析メニューを使用して測定パラメータを設定できます。これらのパラメータは、Excel などのデータ分析プログラムで、標準の測定可能な数量と単位に変換できます。
トレースの幅は、拡張長に対応します。高さは成長期間を表し、折り目の角度は彗星の方向を示す。これらの彗星は、さらにプラスエンドアウトとマイナスエンドアウトに分類され、微小管の相対的な向きを見つけることができます。
EBTA GFPのトランスジェニック発現は、新しい再生などの様々な細胞コンテキストにおける微小管ダイナミクスを観察するように適応することができる。領域評価軸索の微小管ダイナミクスを観察するために、軸索はフェムト秒レーザーを使用して負傷し、大規模な担保損傷を引き起こすことなく軸索を正確に切断することができます。損傷後、ワームは後の観察のためにシードされたエンジンプレートに回収することができる。
PLMニューロンは、損傷後6時間で早くも観察することができる堅牢なエキセネリー再生を示す。新たな権利を再生する光毒性を防ぐために、生画像化は回転ディスク顕微鏡で行われる。再生軸索のタイムラプス獲得は、後で彗星の分析のためにカイモグラフに変換することができます。
彗星の距離の長さと方向は、微小管の向きとダイナミクスの観点から解釈することができます。私の重要な方向性とダイナミクスは、細胞分裂、移動、細胞アーキテクチャの維持などの民間細胞プロセスの重要な決定者です。生体内での微小管ダイナミクスの測定には多くのツールが利用できますが、難しい場合があります。
自己花序、光毒性、過発現アーティファクト、および可変報告強度は、エンド結合タンパク質の実観察中に遭遇する困難の一部であり、微小管ダイナミクスを評価する。この研究は、低濃度のDNAおよび低照度イメージングを伴う統合トランスジェニックを使用して、これらの課題のいくつかを軽減する方法に取り組んできた。ここで説明するイメージングおよび分析モジュールは、他の微小管ベースのレポーターおよびタンパク質輸送に向けて拡張することができる。
これは、C.エレガンスニューロンに適用されるだけでなく、他の細胞タイプやモデルシステムにも適用できます。
