Il test di protezione enzimatica consente di studiare l'entità dell'internalizzazione dello Staph aureus e la sua capacità di sopravvivere all'interno delle cellule aderenti, nonché l'efficacia del composto antimicrobico. Il test di protezione enzimatica migliorato semplifica notevolmente la gestione tecnica e consente di recuperare i batteri interiorizzati da cellule debolmente aderenti e cellule in sospensione. A dimostrare la procedura sarà Josselin Rigaill, medico e dottorando del mio laboratorio.
Due giorni prima del test di infezione, seminare cellule epiteliali A549 ad una densità di 2,0 volte 10 alla quinta cellula per millilitro per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e incubare le cellule per 48 ore a 36 gradi Celsius in 5% di anidride carbonica, fino a raggiungere il 100% di confluenza. Il giorno del test, rimuovere e scartare il terreno di coltura esaurito dai tre pozzetti dedicati al conteggio delle cellule A549 e aggiungere un millilitro di terreno di infezione completo contenente cinque microgrammi per millilitro di Hoechst 33342 e un microgrammo per millilitro di ioduro di propidio. Incubare le cellule per 30 minuti, quindi, utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ampio campo, contare il numero di cellule e calcolare la vitalità cellulare.
Per preparare la sospensione batterica, erogare 25 millilitri di mezzo di infezione completo in un tubo e preriscaldarlo a 36 gradi Celsius. Quindi, regolare la sospensione di Staphylococcus aureus a un OD di 0,5 in un mezzo di infezione completo utilizzando un densimetro cellulare, quindi preparare 20 millilitri di sospensione batterica per l'inoculazione cellulare diluendo la coltura in un mezzo di infezione completo per ottenere un MOI di uno in base al numero di cellule per pozzetto. Successivamente, utilizzando una piastra a spirale automatica, determinare la carica di Staphylococcus aureus della sospensione batterica diluita da utilizzare per la fase di inoculazione cellulare e incubare le piastre di agar per 18-24 ore a 36 gradi Celsius.
Il giorno successivo, conta il numero di colonie con un contatore di colonie per calcolare il MOI accurato per ogni ceppo testato. Prima dell'inoculazione cellulare, osservare ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti con microscopia a basso ingrandimento per assicurarsi che le cellule siano sane e crescano come previsto, quindi rimuovere e scartare il terreno di coltura cellulare esaurito dalla piastra a 24 pozzetti e aggiungere 500 microlitri della sospensione batterica a ciascun pozzo contenente cellule confluenti al 100%. Incubare le cellule per due ore a 36 gradi Celsius in 5% di anidride carbonica.
Per quantificare i batteri intracellulari con il test di protezione enzimatica migliorato, preparare 4x tampone di lisi, 2% Triton X-100, tripsina-EDTA e stock di lisostafina in soluzioni di lavoro come menzionato nel manoscritto di testo. Quindi, preparare 6,25 millilitri di mezzo di infezione completo integrato con lisostafina aggiungendo sei millilitri di mezzo di infezione completo a 250 microlitri della soluzione di lavoro della lisostafina. Quindi, aggiungere 250 microlitri del mezzo di infezione completo integrato con lisostafina in ciascun pozzetto e agitare delicatamente la piastra ruotando la piastra a mano.
Per consentire alla lisostafina di uccidere i batteri extracellulari, incubare le cellule per un'ora a 36 gradi Celsius nel 5% di anidride carbonica, quindi inattivare la lisostafina aggiungendo 10 microlitri di proteinasi K a 20 microgrammi per millilitro in ciascun pozzetto e incubando le cellule per due minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 250 microlitri di tampone di lisi 4x per lisare le cellule mediante shock osmotico e incubare le cellule per 10 minuti a 36 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, pipettare il lisato cellulare su e giù più volte per garantire che le cellule siano completamente lisate e omogeneizzate, quindi utilizzare una piastra a spirale automatica per determinare il carico di Staphylococcus aureus di ciascun pozzo e incubare le piastre di agar per 18-24 ore a 36 gradi Celsius.
Il giorno dopo, conta il numero di colonie con un contatore di colonie per calcolare il carico intracellulare di Staphylococcus aureus di ciascun pozzo. L'internalizzazione di due ceppi di Staphylococcus aureus da parte di cellule epiteliali A549 è raffigurata qui. Utilizzando il test di protezione enzimatica che include lavaggi per rimuovere la lisostafina, i carichi intracellulari medi erano 4,46 e 0,49 log cfu per millilitro per il tipo selvatico SF8300 e il mutante isogenico privo rispettivamente dei geni fnbA e B.
Utilizzando il test di protezione enzimatica migliorato che utilizza la proteinasi K per inattivare la lisostafina, i carichi erano rispettivamente di 4,53 e 0,56 cfu di log per millilitro. L'attività intracellulare di vancomicina, rifampicina e levofloxacina contro lo Staphylococcus aureus misurata utilizzando il saggio di protezione enzimatica è descritta qui. I carichi intracellulari medi erano di 4,57 cfu log per millilitro per il controllo, 4,51 per la vancomicina, 3,03 per la rifampicina e 2,91 per la levofloxacina.
I lavaggi intensivi per rimuovere l'enzima tendono a staccare le cellule più infette, il che può dare risultati imprecisi e supportare l'uso del protocollo migliorato. Il test di protezione enzimatica migliorato rende più facile studiare l'internalizzazione dello stafilococco aureo con organoide e può essere facilmente adattato al sistema di screening ad alto contenuto utilizzato mettendo
