A dimostrare la procedura saranno lo studente laureato Zhe Zhang, lo specialista di ricerca Nannan Zhang, i professori Illker Ozden e Shinghua Ding. L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare astrociti e neuroni di coppia specifici per tipo cellulare e il metodo di targeting mitocondriale per la conta mitocondriale in vitro e in vivo di imaging utilizzando l'indicatore di calcio geneticamente codificato, GCaMP5G e 6s. Per l'imaging in vitro o in vivo, costruiremo plasmidi del DNA contenenti promotori specifici di astrociti o neuroni gfaABC1D o CaMKII e indicatori di calcio geneticamente codificati, GCaMP5G/6s con sequenze di targeting mitocondriale.
Per l'imaging in vitro del calcio mitocondriale abbiamo trasfettato neuroni di astrociti coltivati su scivoli di copertura di vetro con i suddetti plasmidi del DNA utilizzando il metodo Lipofectamine. L'imaging può essere avviato uno o due giorni dopo la trasfezione trasferendo la copertura di vetro scivola nella camera di profusione sotto un microscopio a epifluorescenza o a due fotoni. Ecco alcuni esempi di segnali fluorescenti provenienti da mitocondri e un astrocita che esprime GCaMP6s a sinistra, e per i mitocondri in un neurone, che esprimono GCaMP5G a destra.
Per l'imaging in vivo, abbiamo preparato l'adenovirus associato al sierotipo 5 per l'espressione di mito-GCaMP5G negli astrociti e l'adenovirus associato al sierotipo 9 per l'espressione di mito-GCaMP6 nei neuroni. Per gli interventi chirurgici di iniezione di virus stereotassico, abbiamo prima anestetizzato il topo con il 3% di isoflurano. Successivamente, durante l'intervento chirurgico, i livelli di isoflurano vengono ridotti al 2% Dopo aver raggiunto il corretto livello di anestesia, i capelli sul cuoio capelluto vengono rasati e il topo viene posizionato su uno strumento chirurgico stereotasso.
Un unguento oftalmico viene applicato agli occhi per proteggerli durante l'intervento chirurgico. Gli interventi chirurgici di iniezione vengono eseguiti utilizzando procedure asettiche, compresi strumenti sterili e tecniche asettiche. Gli strumenti chirurgici sono sterilizzati in autoclave o mediante uno sterilizzatore a caldo.
Dopo che il mouse è stato montato sulla stereotassa, il cuoio capelluto viene pulito con betadina e etanolo al 70% tre volte. Quindi la pelle viene tagliata lungo l'asse Bregma Lambda e la verticale viene effettuata da un trapano ad alta velocità sulla posizione target. In questo lavoro, abbiamo preso di mira la corteccia motoria o la paracorteccia.
Una siringa Hamilton calibro 33 che trasporta un vettore di adenovirus associato viene inserita attraverso il foro nel cervello e i vettori vengono iniettati nell'area bersaglio. Per la consegna corticale, iniettiamo la soluzione del virus a due profondità in più passaggi. In primo luogo, inseriamo l'ago a un millimetro di profondità nella corteccia.
Dopo aver concesso cinque minuti al cervello per recuperare, spostiamo l'ago fino a 700 micrometri di profondità, iniettiamo 500 nano litri di soluzione virale. Dopo che l'iniezione è completata, aspettiamo cinque minuti per consentire al virus di diffondersi nel cervello. E poi spostiamo l'ago fino alla seconda posizione di iniezione a 300 micrometri di profondità.
Qui, iniettiamo altri 500 nano litri di soluzione virale. Dopo che l'iniezione è completata, aspettiamo 10 minuti per consentire al virus di diffondersi e quindi rimuoviamo l'ago dal cervello e chiudiamo il foro della bava con cera ossea o Kwik-Sil. Infine, la pelle viene suturata con Vetbond e il topo viene recuperato su una piastra riscaldante prima di essere rimandato alla struttura per animali.
Il mouse sarà pronto per l'uso per l'imaging in vivo in un minimo di tre settimane, che è il periodo di tempo in cui matura l'espressione GCaMP. Gli interventi chirurgici di impianto della finestra cranica vengono eseguiti anche utilizzando condizioni asettiche come descritto per gli interventi chirurgici di iniezione. Le procedure chirurgiche della finestra cranica sono identiche alle procedure chirurgiche di iniezione fino al punto di esposizione del cranio.
Una volta che il cranio è esposto, quarti di una craniotomia di 2-3 mm di diametro sopra l'area iniettata dal virus sono contrassegnati da quattro fori poco profondi fatti da un trapano ad alta velocità attaccato a un manipolatore. Quindi la sezione del cranio, alle gole della craniotomia viene assottigliata forando con cura e lentamente l'osso intorno in un cerchio, collegando questi quattro fori. Una volta che il cranio ai bordi è abbastanza sottile, l'osso viene sollevato con pinzette affilate e rimosso.
La dura madre esposta può essere rimossa o mantenuta intatta per l'impianto della finestra cranica. La nostra finestra cranica è costituita da una copertura in vetro di 3-5 millimetri di diametro, creando un disco in silicone di circa 300 micron di spessore al centro. Il montaggio della finestra cranica si ottiene posizionandolo sopra la craniotomia.
Un pezzo di stuzzicadenti attaccato a un manipolatore viene utilizzato per spingere delicatamente la finestra cranica sulla superficie del cervello. Quindi, il bordo della finestra cranica viene sigillato con una piccola quantità di adesivo siliconico Kwik-Sil. Infine, la finestra cranica è fissata nei bordi del cranio con acrilico dentale.
Bisogna fare attenzione per applicare l'acrilico dentale leggermente sopra i bordi della finestra cranica per un forte legame. Come molti altri gruppi di ricerca hanno implementato in passato, un gel di agarosio all'1,2% può essere utilizzato tra il vetro di copertura e il cervello come alternativa al disco in silicone. Dopo che la finestra cranica è stata installata in modo sicuro, una piastra metallica è attaccata al cranio.
Questa piastra di testa verrà utilizzata per fissare la testa del mouse sul palco di un microscopio a due fotoni durante le sessioni di imaging. L'assorbimento mitocondriale di calcio negli astrociti può essere suscitato dall'applicazione di ATD mentre l'assorbimento di calcio mitocondriale nei neuroni può essere provocato dall'applicazione di glicina glutammato nel liquido spinale cerebrale artificiale, con gravità attraverso un sistema di perfusione. Si può quindi osservare l'assorbimento di calcio nei singoli mitocondri negli astrociti e nei neuroni.
I seguenti film mostrano l'assorbimento mitocondriale di calcio in un astrocita suscitato dall'ATP a sinistra e in un neurone suscitato da glutammato e glicina a destra. L'imaging viene eseguito raccogliendo immagini a due fotoni in vivo time-lapsed di segnali fluorescenti mitocondriali in astrociti e neuroni con un sistema di microscopia a due fotoni Ultima di Prairie Technologies, che è dotato di un milione di laser Ti Sapphire Ultra di Coherent. Utilizziamo le lunghezze d'onda di eccitazione da 880 a 910 nanometri, che sono ottimali per l'imaging in vivo con GCaMP5G e 6s.
Astrociti ed espressione neuron-specifica di mito-GCaMP5G e 6s e riconfermata dalla co-localizzazione dell'etichettatura astrocitaria-specifica di SR101 o del marcatore neurone specifico NeuN. L'assorbimento spontaneo di calcio mitocondriale negli astrociti e nei neuroni in vivo può essere osservato mediante imaging time-lapse utilizzando la microscopia a due fotoni. Le immagini mostrano aumenti spontanei di calcio nei singoli mitocondri in un astrocita a sinistra e un neurone a destra.
I nostri approcci sono utili per l'imaging del calcio mitocondriale specifico del tipo cellulare in vitro e in vivo. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come immaginare l'assorbimento di calcio mitocondriale negli astrociti e nei neuroni.
