In questo esperimento, mioblasti C2C12 cellule vengono seminate ad una densità dato in lastre di cellule Seahorse cultura. Il consumo di ossigeno basale (OCR) e l&#39;acidificazione extracellulare (ECAR) sono misurati per stabilire i tassi di riferimento. 1. Cellule di iniezione Le cellule sono metabolicamente perturbati da tre all&#39;aggiunta di composti diversi (in successione) che spostano il profilo bioenergetico della cellula. Un gruppo servirà come il controllo, con la corsa media, ha aggiunto il controllo &quot;composti&quot;. <ol><li> La prima iniezione è oligomicina. Oligomicina inibisce la sintesi di ATP, bloccando il canale protonico della porzione F o ATP sintasi (complesso V). Nella ricerca mitocondriale, è usato per prevenire lo stato 3 (fosforilazione) respirazione. Con le cellule, può essere utilizzato per distinguere la percentuale di consumo di O2 dedicata alla sintesi di ATP e la percentuale di consumo di O2 necessari per superare la perdita naturale di protoni attraverso la membrana mitocondriale interna. </li><li> La seconda iniezione è FCCP. FCCP (carbonile cianuro-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) è un ionoforo che è un vettore di ioni mobili. Si tratta di un agente disaccoppiamento perché interrompe la sintesi di ATP da trasportare ioni di idrogeno attraverso la membrana mitocondriale invece del canale protonico della ATP sintasi (complesso V). Questo collasso del potenziale di membrana mitocondriale porta ad un rapido consumo di energia e ossigeno senza la produzione di ATP. In questo caso, sia OCR e ECAR aumenterà, OCR a causa di disaccoppiamento, e ECAR come le cellule tentativo di mantenere l&#39;equilibrio energetico utilizzando glicolisi per produrre ATP. FCCP trattamento può essere usata per calcolare la capacità di &quot;ricambio&quot; delle cellule delle vie respiratorie che è definito come la differenza quantitativa tra massima incontrollata OCR e l&#39;iniziale OCR basale. E &#39;stato proposto che il mantenimento di una certa capacità di riserva respiratoria anche in condizioni di massima stimolo fisiologico o fisiopatologico è uno dei principali fattori che definiscono la vitalità e / o la sopravvivenza delle cellule. La capacità delle cellule di rispondere allo stress, in condizioni di maggiore domanda energetica è in gran parte influenzato dalla capacità bioenergetiche dei mitocondri. Questa capacità bioenergetico è determinata da diversi fattori, inclusa la capacità della cellula di fornire supporto ai mitocondri e la capacità funzionale degli enzimi coinvolti nel trasporto degli elettroni </li><li> Nella terza iniezione, rotenone, un inibitore complesso I, si aggiunge alle cellule. Questa si spegnerà la respirazione mitocondriale e consentirà ad entrambe le frazioni mitocondriali e non contribuisce alla respirazione mitocondriale da calcolare. Un osserverà una diminuzione OCR a causa di alterata funzione mitocondriale, con un aumento concomitante ECAR come la cellula si sposta verso uno stato più glicolitica al fine di mantenere il proprio equilibrio energetico Rotenone è un inibitore mitocondriale che impedisce il trasferimento di elettroni dal Fe-S centro Complesso I ubichinone (coenzima Q). Questa inibizione del complesso I impedisce l&#39;energia potenziale in NADH di essere convertito in energia utilizzabile sotto forma di ATP. </li></ol> 2. Reagenti e materiali <ol><li> Oligomicina, FCCP, e soluzioni Rotenone (Seahorse Kit Mito stress test) </li><li> DMEM corsa Media (Seahorse # 100965-000) </li><li> DMSO (Sigma D8418) </li><li> Acqua distillata (Gibco 15230-170) </li><li> Calibrazione del buffer (Seahorse Bioscience) </li></ol> 3. Crescita media <ol><li> 500 ml DMEM (Gibco 11965-092) </li><li> 10% FBS (Hyclone SH90070.03) </li><li> 5 ml Penn / Strep (Gibco 15140-122) </li><li> 5 ml Piruvato di sodio (Sigma S8636) </li><li> 5 ml Glutamax (Gibco 35050-061) </li></ol> 4. Semina protocollo <ol><li> Le cellule sono seminate in piastre di colture cellulari XF96 con 10.000 cellule / pozzetto in 100 ml di mezzo di crescita e posti in incubatore a 37 ° C con 10% di CO 2. </li><li> Cellule aderiscono alla piastra di coltura cellulare XF96 entro 1 ora. </li><li> Cellule saggio in XF96 24 ore dopo la semina. </li></ol> 5. Preparazione del modello di analisi <ol><li> Utilizzando la procedura guidata di analisi (Appendice I), generare un modello con il layout seguente gruppo: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Layout di griglia ben identificare incarichi colonna e di gruppo </li></ol> 6. Composto di preparazione <ol><li> Preparare i seguenti composti in XF DMEM Assay media come segue: 10 oligomicina uM, uM FCCP 30,0, 20,0 Rotenone mM, Queste concentrazioni rappresentano la diluizione 10X, che sarà fatta quando i composti vengono iniettate nel pozzo. Le concentrazioni di lavoro sono: 1 oligomicina uM, 3.0 uM FCCP, 2.0 mM Rotenone </li></ol> 7. Cambia mezzi e preparazione cellulare <ol&gt; <li> Posizionare la piastra cella del Prep XF Stazione </li><li> Impostare il volume finale di media a 160 microlitri per bene. </li><li> Incubare a 37 ° C incubatore senza CO 2 per 60 minuti per consentire alle cellule di pre-equilibrare con il terreno di coltura. </li></ol> 8. Caricamento della cartuccia del sensore <ol><li> Composti calda a 37 ° C prima del caricamento della cartuccia sensore e caricare i composti nelle porte iniettore come segue: <ol><li> Colonne 1-4: Carico 16, 18 e 20 ml di XF Assay media (DMEM) nei porti A, B e C, rispettivamente. </li><li> Colonne 5-12: Carico da 16 ml di oligomicina nei porti A Carico di 18 l di FCCP nei porti B Carico di 20 l di Rotenone nei porti C </li></ol></li></ol> 9. Protocollo comandi <table border="1"><tbody><tr><td> Comando </td><td> Tempo (min) </td><td> Porto </td></tr><tr><td> Calibrare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Equilibrare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Loop End </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> A </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Fine </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Protocollo comandi

<ol>
	<li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li><li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway.">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li><li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion.">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li><li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells:+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li><li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor.">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li><li>Mor&#225;n, M., Rivera, H., S&#225;nchez-Arag&#243;, M., Bl&#225;zquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Mart&#237;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts.">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li><li>C&#225;rdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molg&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2++transfer+to+mitochondria.">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li></ol>

Min Wu, Per Bo Jensen, George W. Rogers e David A. Ferrick sono dipendenti della Seahorse Bioscience, che produce reagenti e strumentazioni presenti in questo articolo.

Questo test è derivato dal classico esperimento per sondare la funzione mitocondriale e funge da quadro con cui costruire esperimenti più complessi volti a comprendere diversi cambiamenti nel metabolismo cellulare, la funzione mitocondriale, e bioenergetica generale. Tutti i composti utilizzati in questo esperimento dovrebbe essere ottimizzato per la concentrazione che fornisce il massimo effetto. Che è, si deve eseguire esperimenti di titolazione separati per accertare questi valori. Questo è particolarmente importante con FCCP, come la curva di titolazione tende ad essere abbastanza forte, e FCCP troppo può effettivamente diminuire risposte in OCR. Range tipico (concentrazioni finali) per testare sarebbe: <ul><li> 0,1-1,0 ug / mL di oligomicina </li><li> 0,1-5,0 uM FCCP </li><li> 0,1-1,0 Rotenone uM </li></ul> Si noti che le risposte a ogni composto sopra (soprattutto FCCP) sarà influenzata dalla composizione del test media (tipo di base, [glucosio], [piruvato], presenza / assenza di BSA, ecc.) Inoltre, se il test XF mezzi di comunicazione la composizione è cambiata, ottimizzazione dovranno essere nuovamente eseguite. La presenza e la concentrazione di piruvato è particolarmente importante per ottenere la massima capacità respiratoria a causa di FCCP. Seahorse Bioscience ha osservato in un numero di linee di cellule che omissione del piruvato abroga la capacità delle cellule di rispondere al massimo (di sopra del basale) per FCCP. Tipicamente, le concentrazioni di piruvato 1-10 mm dovrebbe essere testato per capire la concentrazione ottimale di piruvato di ottenere la massima respirazione. Si noti che [piruvato] E [glucosio] potrebbe essere necessario &quot;cross-titolato&quot; per ottenere le condizioni ottimali dei media per l&#39;esperimento. Risultati tipici di questo esperimento sono presentati qui di seguito in un grafico che mostra OCR in funzione del tempo e un altro che mostra ECAR tempo contro: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. OCR vs Tempo <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. ECAR vs Tempo Qui abbiamo osservato le risposte attese in OCR e ECAR come le cellule vengono trattate con ogni composto successive. Per oligomicina, OCR diminuisce a causa del blocco alla sintesi di ATP mitocondriale Complesso V. Poiché le cellule sono in grado di sintetizzare ATP via OXPHOS, ritornano a glicolisi per soddisfare la loro domanda di ATP, in tal modo si osserva un aumento della ECAR. Come mostrato in precedenza, FCCP agisce come un agente sganciamento. Dal momento che le cellule devono ora superare la perdita di protoni attraverso la membrana mitocondriale interna, OCR aumenta in maniera significativa come più O2 viene consumato per pompare i protoni in eccesso indietro attraverso la membrana mitocondriale. Infine, rotenone inibisce Complesso I mitocondriale e Complesso III, rispettivamente, che fa sì che il flusso di elettroni al cessare della catena di trasporto degli elettroni, e quindi il consumo di O2 è drasticamente ridotto. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Respirazione parametri Al di là dei cambiamenti attesi nella respirazione e ECAR, una serie di parametri respiratori possono essere ottenute da questi dati. Questo è riassunto nella figura sopra: Qui vediamo che si può ottenere informazioni circa la respirazione basale delle cellule, la percentuale di consumo di O2 dedicata alla produzione di ATP e l&#39;importo destinato a mantenere il gradiente di protoni (H + a causa di perdite). Inoltre, possiamo ottenere la massima capacità respiratoria in condizioni di respirazione disaccoppiato (a volte indicato come ricambio capacità respiratoria) e, infine, siamo in grado di determinare la quantità di consumo di O2 non a causa di processi mitocondriali. Un numero sempre crescente di studi stanno utilizzando questo profilo mitocondriale per la valutazione bioenergetica cellulare, identificare la disfunzione mitocondriale e di predire la capacità delle cellule di rispondere allo stress e / o insulti. Per ulteriori informazioni e dettagli su questo metodo sperimentale e l&#39;idea di ricambio capacità respiratoria, consultare riferimento alle seguenti pubblicazioni 1-8.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Mito Stress Test Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM Running Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>100965-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Distilled Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15230-170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calibration buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bioenergetic profile experiment using c2c12 myoblast cells

La capacità di misurare il metabolismo cellulare e comprendere la disfunzione mitocondriale, ha permesso agli scienziati di tutto il mondo per promuovere la loro ricerca nella comprensione del ruolo della funzione mitocondriale nell&#39;obesità, tossicità diabete, invecchiamento, il cancro, la funzione cardiovascolare e sicurezza. Metabolismo cellulare è il processo di assorbimento di substrato, come l&#39;ossigeno, glucosio, acidi grassi, e glutammina, e conversione di energia attraverso una serie successiva di ossidazione enzimatica controllata e reazioni di riduzione. Queste reazioni biochimiche intracellulari risultato nella produzione di ATP, il rilascio di calore e sottoprodotti chimici, come il lattato e CO 2 nell&#39;ambiente extracellulare. Informazioni preziose sullo stato fisiologico delle cellule, e l&#39;alterazione dello stato di queste cellule, può essere ottenuta attraverso la misurazione del tasso di ossigeno consumato da parte delle cellule, un indicatore della respirazione mitocondriale - il tasso di consumo di ossigeno - o OCR. Cellule anche generare ATP attraverso la glicolisi, ovvero: la conversione del glucosio in lattato, indipendente di ossigeno. In pozzi colto, lattato è la fonte primaria di protoni. Misurare l&#39;acido lattico prodotto indirettamente attraverso i protoni rilasciati nel mezzo extracellulare che circonda le cellule, che provoca acidificazione del mezzo fornisce extracellulare Vota acidificazione - o ECAR. In questo esperimento, mioblasti C2C12 cellule vengono seminate ad una densità dato in lastre di cellule Seahorse cultura. Il consumo di ossigeno basale (OCR) e l&#39;acidificazione extracellulare (ECAR) sono misurati per stabilire i tassi di riferimento. Le cellule sono poi metabolicamente perturbati da tre all&#39;aggiunta di composti diversi (in successione) che spostano il profilo bioenergetico della cellula. Questo test è derivato da un esperimento classico per valutare mitocondri e funge da quadro con cui costruire esperimenti più complessi volti a comprendere la funzione sia fisiologici e fisiopatologici dei mitocondri e di predire la capacità delle cellule di rispondere allo stress e / o insulti.

Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells at JoVE.com

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Una descrizione di un metodo per la profilatura funzione mitocondriale nelle cellule è fornito. Il profilo mitocondriale generato fornisce quattro parametri della funzione mitocondriale, che può essere misurata in un esperimento: frequenza respiratoria basale, ATP-linked respirazione, perdita protonica, e la capacità di riserva.

Profilo Esperimento bioenergetica utilizzando cellule dei mioblasti C2C12

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

bioenergetic-profile-experiment-using-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

50.2K Views.  Novato, CA. Una descrizione di un metodo per la profilatura funzione mitocondriale nelle cellule è fornito. Il profilo mitocondriale generato fornisce quattro parametri della funzione mitocondriale, che può essere misurata in un esperimento: frequenza respiratoria basale, ATP-linked respirazione, perdita protonica, e la capacità di riserva.

Video: Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Test di tolleranza nicotina in Afidi Utilizzando un esperimento artificiale dieta

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Ricerca

Biologia

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

Morris Water Maze Esperimento

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Eucarioti Analisi Profilo Polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Preparazione di primaria Miogenica precursori cellulari / Culture mioblasti dal basale vertebrati Lignaggi

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

Real Time Analisi di profilo metabolico in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture del mouse intestinale Cripta organoide

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Il rilevamento di forme modificate di Citosina Uso Sensitive immunoistochimica

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

Sfruttando Live Imaging ai Nuclei di pista durante il differenziamento dei mioblasti e Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...