L'uso di diversi substrati energetici è sia specifico del tipo cellulare che indicativo della malattia. Misurare il consumo dei substrati specifici può far luce sia sulla normale biologia che sulla patologia. La tecnica non ha bisogno di attrezzature specializzate ed è facile da scalare.
È anche più facile da usare rispetto ai metodi pubblicati in precedenza. Comprendere i cambiamenti nel tasso di ossidazione del substrato consentirà lo sviluppo di interventi dietetici e farmacologici per i disturbi metabolici. Sebbene dimostrata con il tessuto osseo, questa tecnica è facilmente personalizzabile per studiare la flessibilità metabolica in tutti i tipi di cellule fornendo una comprensione sia delle cause che delle conseguenze dei cambiamenti metabolici.
Dopo aver sacrificato i cuccioli da tre a cinque giorni postnatali, trasferirli in D PBS ghiacciato contenente penicillina streptomicina doppia soluzione antibiotica. Esporre la calvaria rimuovendo la pelle e i tessuti molli. Raccogliere la regione centrale tagliando i tessuti circostanti da dietro a davanti in D PBS.
Gratta delicatamente le superfici interne ed esterne della calvaria usando una pinzetta per aiutare a rilasciare le cellule dopo la successiva digestione. Preparare soluzioni da 2 e 4 milligrammi per millilitro di collagenasi di tipo due in D PBS e filtrare ogni soluzione con un filtro micrometro fresco da 0,22. In primo luogo, digerire la calvaria pulita con due milligrammi per millilitro di soluzione di collagenasi per 15 minuti, quindi scartare la soluzione di digestione.
Quindi, digerire i campioni puliti in quattro milligrammi per millilitro di soluzione di collagenasi tre volte per 15 minuti ogni volta. Quindi, tirare la soluzione di digestione e salvarla. Filtrare la soluzione di digestione attraverso filtri a celle da 70 micrometri e centrifugare il filtrato a 300 RCF per cinque minuti.
Sospendere il pellet cellulare in mezzo mem alfa completo contenente il 10% di FBS e penicillina streptomicina doppia soluzione antibiotica. Conta e semina le cellule in un piatto di 10 centimetri. Coltiva le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per tre giorni.
Quindi, dissociare le cellule a 37 gradi Celsius con 0,25 tripsina EDTA. Dopo la digestione, contare e seminare le cellule in una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti con un mezzo meM alfa completo contenente il 10% di FBS e la penicillina streptomicina doppia soluzione antibiotica. Seminare almeno quattro pozzetti per tipo di cellula per substrato e almeno tre pozzetti extra per ogni tipo di cellula per il conteggio pre-saggio.
Coltiva le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo aver rimosso il muscolo e il tessuto connettivo da topi di otto settimane e raccolto femori e tibie, tagliare e scartare entrambe le estremità delle ossa con forbici affilate. Sciacquare il midollo osseo da un femore e una tibia in una capsula di Petri fresca di 10 centimetri con una siringa dotata di un ago calibro 23 contenente 15 millilitri di mezzo meM alfa completo con soluzione antibiotica doppia di penicillina streptomicina al 10% FBS e 10% CGM 14 12 mezzo condizionato.
Coltiva le cellule nella capsula di Petri in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo tre giorni scartare il terreno di coltura e risciacquare le cellule con D PBS. Dissociare le cellule attaccate a 37 gradi Celsius con 0,25% di tripsina EDTA per cinque minuti.
Dopo la centrifugazione, sospendere nuovamente il pellet di cella nel mezzo BMM. Contare e seminare le cellule in una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti secondo la procedura descritta in precedenza. Coltura a 37 gradi Celsius durante la notte nel mezzo BMM prima di iniziare i test.
Lavare le cellule nei pozzetti extra due volte con D PBS. Dissociare le cellule con 0,25% tripsina EDTA. Sospendere 20 microlitri di cellule digerite in D PBS.
Con 20 microlitri di soluzione di colorante acridina arancio e ioduro di propidio, determinare il numero di cellule vive con un contatore cellulare automatizzato e registrare il numero. Lavare le cellule nei pozzetti di analisi due volte con D PBS. Aggiungere 500 microlitri di mezzo caldo a ciascun test bene nella cappa di coltura tissutale designata ram.
Dopo aver sigillato la piastra con parafilm, incubare le cellule in un incubatore designato RAM a 37 gradi Celsius per 4 ore. Durante l'incubazione, tagliare la carta da filtro in pezzi circolari, leggermente più grandi dell'area all'interno del tappo del tubo della microcentrifuga da 1,5 millilitri e inserire la carta comodamente nel tappo. Aggiungere 200 microlitri di un acido perclorico molare 1 a ciascun tubo e 20 microlitri di idrossido di sodio alla carta da filtro montata all'interno del tappo.
Dopo aver incubato le cellule, trasferire 400 microlitri di terreno di coltura da ciascun pozzo ai tubi preparati e chiudere immediatamente i tappi. Lasciare i tubi in un portatubi a temperatura ambiente per un'ora. Parallelae durante l'incubazione predispone una fiala di scintillazione per ogni tubo e la riempie con quattro millilitri di fluido di scintillazione.
Trasferire ogni pezzo di carta da filtro in un flaconcino scintillante e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Eseguire test di pulizia sulla cappa di coltura del tessuto, sul bagno d'acqua, sul frigorifero, sull'incubatore, sul lavandino, sul terreno e su qualsiasi altra area di lavoro per una potenziale contaminazione da RAM. Mettere le salviette di carta in flaconcini di scintillazione contenenti liquido di scintillazione.
Misurare l'attività radio del carbonio 14 nelle fiale di scintillazione con un contatore di scintillazione e registrare i risultati di lettura. Decontaminare l'ambiente di lavoro, secondo le linee guida sulla sicurezza delle radiazioni, se necessario. La figura confronta l'ossidazione del substrato da parte di pre osteoblasti primari di calvaria rispetto ai BMM.
Dopo che le cellule primarie sono passate e coltivate in mezzo MEM alfa completo durante la notte, in genere raggiungono l'80-90% di confluenza e mostrano la loro morfologia caratteristica. I pre osteoblasti calvariali sono notevolmente più grandi dei BBM. I risultati dell'ossidazione del substrato hanno mostrato che il tasso di ossidazione per ciascun substrato è significativamente più alto nei pre osteoblasti calvariali rispetto ai BBM, probabilmente indicando una maggiore produzione di energia per fosforilazione ossidativa nei pre osteoblasti.
La terza carta inserita deve essere leggermente più grande di un tappo del tubo superiore da 1,7 millilitri. Questo metodo può essere utilizzato in combinazione con il consumo di ossigeno e per determinare il tasso complessivo di fosforilazione ossidativa e produzione lattativa nelle cellule. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare l'utilizzo del substrato durante fasi di differenziazione distinte o impostazioni della malattia.
Con questa conoscenza possiamo sviluppare interventi per i disturbi metabolici.
