I paradigmi di apprendimento associativo sensoriale hanno rivelato molto sulla funzione del cervelletto e sulla sua relazione con il resto del cervello e sul comportamento. Usando il topo come organismo modello, presentiamo un metodo con dettagli sufficienti per i laboratori di tutto il mondo per implementare questi potenti metodi in modo efficace ed economico. Il nostro protocollo consentirà ai ricercatori di impostare più comportamenti dipendenti dal cervelletto.
Le funzioni principali della nostra piattaforma di ricerca possono essere facilmente modificate per adattarsi a una particolare domanda di ricerca. Per iniziare, collegare il cavo di interfaccia seriale della fotocamera alla fotocamera e la porta della fotocamera sull'SBC. Quindi scaricare il sistema operativo per l'SBC sul computer host e creare un file chiamato ssh nella scheda microSD.
Espellere la scheda microSD dalla macchina host. Inserirlo nello slot per schede microSD SBC e alimentare l'SBC. Successivamente, per preparare l'SBC ad accettare una connessione cablata all'host, aprire un terminale, digitare il comando ifconfig"e registrare l'indirizzo IP Ethernet dell'SBC.
Quindi vai alla scheda Interfaccia dell'impostazione Configurazione Raspberry Pi e abilita le opzioni per fotocamera, SSH e VNC. Per stabilire la connessione cablata, collegare un cavo Ethernet alla porta Ethernet dell'SBC e di un computer host e collegare l'altra estremità di questi cavi a uno switch Ethernet. Quindi, utilizzando un client di elaborazione di rete virtuale, ad esempio VNC, accedere al desktop utilizzando l'indirizzo IP SBC e l'autenticazione predefinita.
Quindi, scaricare il software richiesto e le librerie Python necessarie per SBC. Per consentire il controllo diretto sul microcontrollore, scaricare l'ambiente di sviluppo integrato del microcontrollore o il software IDE. Quindi aprire una finestra del terminale SBC, passare alla directory Download e installare l'IDE.
Dopo aver aperto l'IDE del microcontrollore, selezionare Strumenti, quindi Gestisci librerie e installare la libreria Encoder di Paul Stoffregen. Infine, inserire una chiavetta USB in una porta USB dell'SBC e immettere i comandi per il montaggio del dispositivo di archiviazione esterno USB. Dopo aver collegato l'SBC alla porta di programmazione del microcontrollore, aprire lo sketch di download con l'IDE del microcontrollore e caricarlo sul microcontrollore.
Quindi, scaricare e installare la versione appropriata dell'IDE Arduino sul computer host. Quindi scarica il DTSC_US. ino sketch al computer host.
Collegare il cavo da USB A a USB B al computer host e al microcontrollore. Apri lo sketch e caricalo sul microcontrollore. Collegare i fili alla breadboard del microcontrollore, ai LED, all'encoder rotativo, al motore passo-passo con un driver e all'elettrovalvola con driver.
Quindi collegare un canale di un alimentatore ai pin V positivi e GND del driver del motore passo-passo. Dopo aver acceso l'alimentatore, impostare la tensione del canale collegato su 25 volt. Quindi, collegare il cavo positivo di un alimentatore al pin di tensione di tenuta del driver dell'elettrovalvola e l'altro cavo positivo al pin di tensione spike.
Dopo aver acceso l'alimentatore, impostare il canale collegato alla tensione di picco a 12 volt e il canale collegato alla tensione di attesa a 2,5 volt. Quindi collegare una fonte d'aria regolata a una pressione di 20 libbre per pollice quadrato all'elettrovalvola. Successivamente, per realizzare la ruota da corsa, tagliare una ruota da tre pollici da un rullo di schiuma e praticare un foro di un quarto di pollice nel centro esatto della ruota.
Quindi inserire un albero da un quarto di pollice nella ruota e fissarlo in posizione utilizzando mozzi di serraggio. Fissare l'encoder rotativo su un canale in alluminio da 4,5 pollici. Quindi stabilizzare il canale in alluminio sulla breadboard in alluminio.
Dopo aver collegato la ruota all'encoder rotativo, stabilizzare il lato libero dell'albero della ruota con un cuscinetto inserito in un morsetto terminale ad angolo retto, installato su un montante ottico montato su breadboard. Quindi, posizionare i poggiatesta utilizzando montanti ottici e morsetti ad angolo retto. Quindi posizionare il LED di stimolo condizionale e l'uscita dell'elettrovalvola per lo stimolo incondizionato DEC attorno alla ruota assemblata.
Quindi, montare il motore passo-passo utilizzato per lo stimolo incondizionato DTSC e la fotocamera Pi su un palo ottico. Posiziona l'array di luce a infrarossi sullo stesso lato della Pi Camera, leggermente sopra e direttamente rivolto verso il punto in cui verrà posizionata la faccia dell'animale. Crea uno stimolo tattile per il condizionamento dello startle tattile ritardato nastrando la schiuma sul bordo di un pezzo di acrilico.
Montare su un albero da un quarto di pollice utilizzando un mozzo di serraggio, quindi collegare lo stimolo tattile all'albero motore passo-passo. Per impiantare una piastra frontale, anestetizzare il mouse, quindi praticare un'incisione con un bisturi lungo la linea mediana del cuoio capelluto, dal bordo posteriore degli occhi al cranio. Stendere l'incisione aperta e bloccare entrambi i lati con emostati per tenerla aperta.
Usando la colla cianoacrilata, attaccare la piastra della testa al cranio. Quindi applicare una miscela di polvere di cemento dentale, solvente e catalizzatore su tutte le aree dell'osso esposto. Suturare la pelle chiusa, dietro e davanti alla piastra della testa.
Quindi iniettare analgesia postoperatoria, consentendo al topo di recuperare per almeno cinque giorni. Per preparare i topi alle sessioni comportamentali, consenti loro di abituarsi alla piattaforma montandoli nel poggiatesta. Prima della sessione, assicurarsi che l'uscita dell'elettrovalvola sia centrata sull'occhio bersaglio, posizionata a meno di un centimetro di distanza, e che lo stimolo tattile sia centrato sul naso del topo, posizionato a circa 1,5 centimetri di distanza.
Per la preparazione della sessione DTSC, avviare la GUI da un terminale SBC. Eseguire una sessione di test di tre prove e assicurarsi che i dati registrati che vengono stampati sul terminale mostrino una deflessione superiore a 20, ma inferiore a 100 passaggi. Per eseguire una sessione, montare un mouse sul poggiatesta e avviare la GUI dal terminale SBC.
Per salvare le registrazioni della videocamera, premi il pulsante Stream prima di iniziare la sessione. Inserisci le informazioni di identificazione per l'animale nel campo ID animale e premi il pulsante Imposta. Quindi inserisci i parametri dell'esperimento desiderato e premi il pulsante Carica su Arduino.
Infine, premi Avvia sessione per iniziare la sessione. I risultati dell'allenamento DEC di una sessione di registrazione con illuminazione accettabile sono mostrati qui. Le condizioni di illuminazione accettabili hanno comportato un buon contrasto tra l'occhio e la pelliccia perioculare.
Le prestazioni di un singolo topo addestrato per otto sessioni hanno mostrato tracce comportamentali, senza alcuna risposta condizionata nel topo non addestrato e robuste risposte condizionate una volta che il mouse è stato addestrato. Un video di prova di esempio mostra un mouse addestrato che chiude con successo l'occhio in risposta allo stimolo condizionale del LED, mentre il mouse non allenato non lampeggia fino allo stimolo incondizionato. La risposta condizionata aumenta di dimensioni e frequenza attraverso sessioni comportamentali eseguite nell'arco di giorni.
Condizioni di illuminazione non ottimali limitano fortemente la qualità dei dati acquisiti. Quando il contrasto tra l'occhio e la pelliccia circostante è basso, lievi cambiamenti nell'immagine possono alterare significativamente la forma registrata della risposta incondizionata in una singola sessione e ridurre il rapporto segnale-rumore per rilevare la posizione delle palpebre. I risultati dell'allenamento DTSC per un mouse addestrato per cinque sessioni sono presentati qui.
Un video di prova di esempio mostra un mouse addestrato che supporta con successo la rotellina in risposta allo stimolo condizionale del LED, mentre un mouse non addestrato non riesce a muovere la rotellina fino a quando non viene applicato lo stimolo tattile incondizionato. La frequenza e l'ampiezza della risposta condizionata aumentano man mano che l'allenamento procede. In una coorte di animali addestrati con uno stimolo incondizionato che ha prodotto risposte incondizionate a bassa ampiezza, nessun animale ha imparato a produrre costantemente risposte condizionate dopo quattro giorni di addestramento.
Per un comportamento di successo, il comfort dell'animale durante la corsa sul carro è fondamentale. È importante assicurarsi che la ruota giri liberamente e in modo uniforme prima di abituare gli animali al carro. Utilizzando questa piattaforma flessibile, abbiamo ripreso e perturbato con successo l'attività dei neuroni di Purkinje, le cellule di uscita del cervelletto, durante l'apprendimento negli animali fissi.
