Questi protocolli servono come linee guida di best practice per la generazione di polvere ossea da utilizzare nell'estrazione del DNA a valle attraverso una serie di elementi scheletrici. Ci sono alcuni protocolli di campionamento del DNA antichi pubblicati per luoghi diversi dalla dentina e dalla piramide petrosa. Oggi mostreremo i metodi di campionamento dettagliati per tre alternative.
Questi metodi mostrano anche un grande potenziale per l'uso con resti forensi degradati, ma anche come base per lo sviluppo di tecniche simili con campioni non umani. Eseguire tutti i campionamenti in una camera bianca dedicata, sotto una cappa PCR dotata di luce UV o un armadio di biosicurezza. Spegnere il flusso d'aria e distribuire un foglio di alluminio sterile sul piano del banco per catturare eventuali polvere ossea vagante o frammenti.
Introdurre un foglio di carta da pesare in una teglia sterile. Tenere il molare decontaminato per lo smalto con la radice rivolta verso il basso sopra un vassoio di pesatura, usando un morsetto portatile. Equipaggiare un trapano dentale con una ruota da taglio circolare diamantata.
Con il trapano impostato su un'impostazione di velocità media, toccare leggermente il bordo del trapano fino alla radice con un angolo di circa 20 gradi. Raschiare il campione verso il basso nel vassoio per raccogliere il materiale giallo più esterno dalla radice. Interrompere la raccolta una volta che il materiale più leggero della dentina diventa visibile.
Trasferire la polvere in un tubo LoBind Safe-Lock da due millilitri e registrare questa massa raccolta di polvere utilizzando una bilancia chiusa con una precisione di almeno 0,01 milligrammi. Trasferire la polvere dalla carta pesata a un tubo LoBind Safe-Lock da due millilitri per l'estrazione. Conservare questo tubo a 20 gradi Celsius.
Assicurarsi di recuperare tutti i frammenti ossei e quanta più polvere possibile. Cambiare la pellicola tra un campionamento e l'altro, smaltire la pellicola usata in una sacca autoclavabile a rischio biologico. Decontaminare l'area di lavoro e distribuire ogni volta un foglio di alluminio sterile sul piano del banco prima di passare all'osso successivo.
Inserire un piccolo foglio di carta pesata in una vaschetta di pesata standard. Rimuovere e scartare lo strato più esterno dell'osso corticale dell'arco vertebrale superiore utilizzando un trapano dentale. Quindi, fissare le vertebre in un morsetto a mano, con il processo spinoso verso l'esterno e l'aspetto superiore verso il basso.
Mentre si tiene la vertebra, forare verso l'alto il centro della tacca a forma di V, formata dalla fusione del processo spinoso con le lamelle a bassa velocità e coppia elevata. Cessare la perforazione quando c'è un notevole calo della resistenza. Cambiare leggermente la posizione di perforazione e ripetere fino a raccogliere da 50 a 100 milligrammi di polvere ossea.
Trasferire la polvere ossea dalla carta pesata a un tubo LoBind da due millilitri per l'estrazione e conservarla a 20 gradi Celsius. Assicurarsi che tutti i frammenti ossei e quanta più polvere possibile vengano recuperati prima di smaltire un foglio. Decontaminare l'area di lavoro e preparare per la raccolta dei campioni, come descritto in precedenza.
Posizionare un piccolo foglio di carta da pesata in un vassoio di pesata standard. Tenere la cupola dell'astragalo verso l'alto e la superficie mediale verso il collettore, sopra il vassoio di pesatura. Raschiare l'osso corticale a una profondità di circa un millimetro dal collo dell'astragalo utilizzando un trapano dentale con una punta a basso calibro impostata su bassa velocità e coppia elevata.
Cambiare la posizione di perforazione e ripetere questa operazione fino a raccogliere circa 50-100 milligrammi di polvere ossea. Trasferire questa polvere ossea dalla carta pesata a un tubo LoBind da due millilitri per l'estrazione. Conservare la polvere a 20 gradi Celsius a tempo indeterminato.
Conservare l'osso rimanente e la polvere in eccesso in un ambiente sterile asciutto e a temperatura controllata a 25 gradi Celsius. Smaltire tutti i rifiuti in sacchetti o recipienti a rischio biologico in autoclave. Sterilizzare o decontaminare tutte le apparecchiature riutilizzabili ed esporle ai raggi UV tra un campionamento e l'altro.
La Pars petrosa ha prodotto DNA endogeno più elevato rispetto alle altre 23 posizioni di campionamento anatomico esaminate. Le sette ulteriori posizioni di campionamento anatomico presentate in questo protocollo hanno prodotto le successive rese più elevate. Le posizioni alternative hanno prodotto costantemente rese di DNA adeguate per le analisi standard di genetica delle popolazioni.
I tassi di duplicazione nelle librerie derivanti da tutte le posizioni di campionamento anatomico erano bassi, indicando un'elevata complessità. I denti e le vertebre toraciche hanno mostrato un adeguato recupero molecolare. Uno degli aspetti più impegnativi del campionamento osseo è il processo di perforazione, ad esempio come tenere un trapano, dove perforare e quando interrompere la perforazione.
