Il rilevamento delle impronte digitali del DNA è uno strumento comune nelle scienze biologiche e applicato nei test di paternità, nonché negli studi forensi o filogenetici. Questo protocollo è progettato per fornire agli studenti universitari i principi di base del rilevamento delle impronte digitali del DNA nelle classi di laboratorio. Si basa sul locus D1S80 umano, un numero variabile di regioni di ripetizioni tandem, che gli alleli possono differire di lunghezza tra gli individui.
L'estrazione del DNA, la PCR, l'elettroforesi del gel e la successiva analisi possono essere difficili da eseguire, specialmente se fatte per la prima volta. La dimostrazione visiva di tutti i passaggi consente agli spettatori di osservare la pratica generale, i dettagli e le precauzioni che devono essere prese durante l'esecuzione di questo protocollo molto robusto. Per estrarre il DNA dalle cellule epiteliali della mucosa buccale, iniziare raccogliendo le cellule usando un tampone orale sterile.
Utilizzare un tampone per strofinare vigorosamente all'interno della guancia per 30-40 secondi. Posizionare la punta del tampone di raccolta nel tubo di micro-centrifuga sterile etichettato e rompere la lunghezza della plastica che si estende oltre il bordo e chiudere il tubo. Preriscaldare un blocco riscaldante a 65 gradi Celsius e preparare tutti i buffer e le soluzioni necessari.
Aggiungere 500 microlitri di soluzione di lyse al tampone, assicurandosi che il campione sia completamente immerso nella soluzione di lyse e vortice del campione per almeno cinque secondi. Incubare il campione per 10 minuti a 65 gradi Celsius e vortice occasionalmente. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone premendolo contro la parete del tubo per ottenere un volume massimo del campione.
Aggiungere un tampone di denaturazione a 100 microliter per le cellule di lyse e mescolare accuratamente invertendo il tubo fino a quando un precipitato bianco diventa visibile. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare il campione per cinque minuti a 17.950 G.Trasferire 450 microlitri del supernatante in un tubo di microcentfuga pulito da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere 450 microliter di iso 2-propanolo e mescolare accuratamente invertendo il tubo per far precipitare il DNA.
Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente e centrifugare per cinque minuti. Scartare il supernatante e invertire il tubo su un tovagliolo di carta pulito e asciugare il pellet. Lavare il DNA con 500 microliter di 70% di etanolo, centrifugare poco per un minuto e scartare il supernatante.
Per asciugare completamente il pellet, incubare il campione per cinque minuti a 65 gradi Celsius in un blocco riscaldante. Infine, aggiungere 30 microlitri di tampone di eluizione e incubare per 10 minuti a 65 gradi Celsius per inattivare il sistema del DNA. Preparare il mix master aggiungendo il buffer PCR verde, dntp, primer, acqua e polimerasi al tubo di micro-centrifuga.
Etichettare i tubi PCR con numeri di campione e aliquote 45 microlitri del mix master PCR su ciascun tubo PCR. Quindi, aggiungere cinque DNA di microlitri o, per il controllo senza modello, aggiungere acqua. Chiudere i tubi PCR e centrifugarli brevemente.
Posizionare i tubi nel ciclore termico e avviare il programma PCR. Al termine del programma, conservare i campioni a quattro gradi Celsius fino a un'ulteriore elaborazione. Preparare un gel di agarosio all'1,5% pesando 1 1/2 grammi di polvere di agarosio e mescolandolo con 100 millilitri di soluzione tampone TAE in una bottiglia.
Scaldare accuratamente la miscela di agarosio in un forno a microonde e ruotare la miscela nel mezzo fino a quando l'agarosio non si è completamente sciolto. Tenere presente che potrebbero verificarsi ritardi di ebollizione. Dopo un breve raffreddamento della miscela di agarosio, aggiungere due microlitri di pec verde.
Versare il gel e utilizzare un pettine con abbastanza pozzali per i campioni. Dopo la completa polimerizzazione del gel di agarosio, caricare i pozzi con 10 microliter di ciascuno dei campioni PCR e aggiungere uno standard di peso molecolare ai pozzi di fianco. Eseguire il gel a 150 volt per circa 40 minuti.
Per visualizzare i prodotti PCR, immagini il gel usando la luce ultravioletta. Per l'analisi degli alleli amplificati D1S80, posizionare un righello accanto allo standard di peso molecolare a partire dai pozzi sull'immagine del gel fotografico. Misurare la distanza per ogni banda dello standard di peso e registrare le lunghezze in un programma di calcolo della tabella.
Successivamente, determinare il logaritmo di ogni dimensione del frammento dello standard di peso. Inserire uno scatterplot utilizzando frammenti log-transformed standard di peso e le distanze misurate dal gel. Adattare una linea di tendenza e visualizzare l'equazione di regressione e il valore R-quadrato.
In una nuova tabella, inserire le distanze delle misure dagli ampli PCR ai pozzi. Per determinare la dimensione di questi ampliconi, utilizzare l'equazione di regressione dalla regressione lineare e calcolare l'antilogo per ottenere le dimensioni dei frammenti in coppie di basi dagli ampliconi. Assegnare infine le unità di ripetizione di 16 coppie di basi a ogni amplicon misurato.
L'estrazione del DNA e l'amplificazione del locus D1S80 ebbe successo per tutti gli individui studiati, e il controllo senza modello nella corsia 10 non mostrava ampliconi. Dall'analisi della lunghezza dei frammenti, gli individui sono stati classificati come omozigoti o eterozigoti con due alleli. Il numero di unità ripetute delle ripetizioni tandem era chiaramente riconoscibile e ora può servire per ulteriori analisi.
Qui descriviamo un metodo semplice ed economico per implementare il rilevamento delle impronte digitali molecolari nelle classi pratiche universitarie. L'intera procedura può essere completata entro un'unica giornata lavorativa e comprende quattro diversi passaggi. Nella prima fase, viene preparato il modello di DNA.
Le cellule epiteliali buccali vengono raccolte mediante campionamento del tampone. I tamponi orali sono uno strumento affidabile per fornire quantità e qualità sufficienti di cellule per l'estrazione del DNA. Inoltre, il protocollo di estrazione del DNA non utilizza solventi organici, il che è vantaggioso nelle classi di laboratorio universitarie.
Il primo passaggio può essere completato in 90 minuti o meno. Nella seconda fase, il locus D1S80 viene amplificato dalla PCR. Le condizioni PCR qui presentate sono robuste anche in caso di scarsa qualità del modello DI DNA.
Questo passaggio può essere completato in 2 ore e mezza. I prodotti PCR vengono quindi analizzati per elettroforesi a gel di agarosio. L'elettroforesi del gel di agarosio ha molti vantaggi rispetto ad altre tecniche, come l'evitare componenti pericolosi e una semplice tecnica di preparazione.
Questa analisi può essere completata in 90 minuti. Dopo l'elettroforesi, i risultati della lunghezza del frammento possono essere analizzati entro 90 minuti mediante analisi di regressione lineare, eseguita utilizzando un programma di calcolo della tabella o utilizzando una semplice calcolatrice. In sintesi, il metodo di rilevamento delle impronte digitali presentato può essere utilizzato in pratici per insegnare l'uso di marcatori molecolari e la sua applicazione nelle scienze biologiche.
