Name: protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1
Uploaded: 2017-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
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Ringraziamo Shanghai Tolo Biotech per la loro assistenza tecnica durante lo sviluppo del C-Brick standard. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Programma di Ricerca di Priorità Strategica dell&#39;Accademia Cinese delle Scienze (Grant No. XDB19040200).

1. Preparazione di crRNA <ol><li> Preparazione di modelli di crRNA <ol><li> Riassemblare singoli oligonucleotidi ( Tabella 1 ) in acqua libera da RNasi a una concentrazione di 10 μM. </li><li> Aggiungere 22,5 μL di oligonucleotide di prima riga (T7-F nella tabella 1 ), 22,5 μL oligonucleotide a filo di fondo ( Tabella 1 ) e 5 μl di tampone di ricottura 10 volte a un tubo PCR da 0,2 ml. Assicurarsi che il volume totale sia di 50 μL. NOTA: Sei differenti oligonucleotidi di fondo sono riportati nella Tabella 1 , ognuno dei quali deve essere accoppiato singolarmente con il top-strand T7-F. Le lettere minuscole della Tabella 1 rappresentano la sequenza da trascrivere nella sequenza di guida di crRNA. Può essere utilizzato 10x Taq PCR buffer invece del buffer di ricottura 10x. </li><li> Posizionare il tubo PCR in un termociclatore. </li><li> Eseguire il programma di ricottura: denaturazione iniziale a 95 ° C per5 min e poi un cooldown da 95-20 ° C, con una diminuzione di 1 ° C per min sul termociclatore. NOTA: Utilizzare immediatamente i campioni per la fase 1.2.1. </li></ol></li><li> Trascrizione e purificazione di crRNA <ol><li> Aggiungere 38 μl di acqua priva di RNasi, 8 μl di template dalla fase 1.1.4, 20 μl di 5x T7 tolleratore di transcrizione, 20 μL di miscela NTP (10 μM), 4 μL di inibitore RNasi ricombinante (RRI) e 10 ΜL di T7 RNA polimerasi in un tubo da 1,5 ml di microcentrifuga. Assicurarsi che il volume totale sia di 100 μL. </li><li> Mettere il tubo di microcentrifuga in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C per una notte (per circa 16 ore). </li><li> Utilizzare un kit di pulizia e concentrazione di RNA per purificare l&#39;RNA trascritto; Seguire il protocollo del produttore. </li><li> Quantitate gli RNA con spettrofotometri UV-Vis e diluire l&#39;RNA a una concentrazione di 10 μM. Usare immediatamente i campioni o conservarli a -80 ° C. NOTA: la sequenza crRNAS sono elencati nella tabella 2 . </li></ol></li></ol> 2. Costruzione di parti in C-Brick ( cioè l&#39;inserimento di parti biologiche in un vettore standard C-Brick) NOTA: Questo passaggio ha tre sottoprogrammi. Per le parti biologiche corte ( ad esempio, promotori e terminatori), è meglio utilizzare il metodo diretto di PCR per inserire le parti biologiche in un vettore standard C-Brick4. L&#39;intera sequenza vettoriale è mostrata nei dati supplementari e la sequenza di prefisso e suffisso è mostrata in Figura 1 (punto 2.1, di seguito). Per le parti biologiche che possono essere facilmente ottenute tramite PCR ( ad es. Con modelli di DNA genomico, plasmidi o sequenze DNA sintetizzate), è consigliabile utilizzare il metodo di assemblaggio senza soluzione di continuità per inserire le parti biologiche in un vettore standard C-Brick (Punto 2.2, di seguito). Per quelle parti ottenute da standard BioBrick e BglBrick, restrizioneLa digestione mediata da enzimi e la legatura ligasi mediata con T4 DNA può essere utilizzata per inserire le parti biologiche in un vettore standard di C-Brick (fase 2.3). <ol><li> Costruzione tramite amplificazione diretta PCR <ol><li> Progettare e ordinare oligonucleotidi per amplificazione PCR. NOTA: La 5&#39;estremità dell&#39;oligonucleotide contiene la sequenza della parte del DNA e la 3&#39;-estremità dell&#39;oligonucleotide contiene la sequenza vettoriale ( cioè &quot;GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG&quot; alla estremità 3&#39;&#39;stringa avanzata e &#39;GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG&#39; Nel filo inverso). Non si può progettare alcuna sovrapposizione o un sbalzo di 20 bp alla 5 &#39;dell&#39;oligonucleotide. Esempi specifici possono essere trovati in uno studio precedente 4 . </li><li> Riassemblare singoli oligonucleotidi in acqua ultra-pura a una concentrazione di 10 μM. </li><li> Impostare reazioni PCR sul ghiaccio in un tubo PCR da 0,2 ml: aggiungere 18 μl di acqua ultra-pura, 25 μL di 2x PCR buffer, 1 μL di dNTPs (10 μM), 2,5 μL di ciascuno dei primer in avanti e invertire (10 μM) dalla fase 2.1.2, 0,5 μL di vettore standard C-Brick (50 ng) come template e 0,5 μL Di DNA polimerasi ad alta fedeltà. Assicurarsi che il volume totale sia di 50 μL. </li><li> Posizionare il tubo direttamente in un termociclatore e avviare il programma del termociclatore. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C. </li><li> Programma termociclatore: un ciclo per 3 min a 98 ° C; Trenta cicli per 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C e 2 min a 72 ° C; E un ciclo per 10 min a 72 ° C. Tenere il campione a 16 ° C. </li><li> Aggiungere 9 μL di miscela dal punto 2.1.4 a un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 1 μl di DpnI e incubare per 1 h in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C. NOTA: Se i primer non hanno sequenze sovrapposte, aggiungere 0,5 μL di polinucleotide chinasi T4 (PNK) e 0,5 μL di ligasi del DNA di T4 e incubare inUn bagno d&#39;acqua di 22 ° C per 1 h. Altrimenti, se i primer contengono una sequenza di sovrapposizione di ~ 20 nt, trasformano direttamente i prodotti trattati con DpnI in cellule E. coli (DH10B) -competenti (fase 2.4). Il prodotto PCR linearizzato sarà circolarizzato dal sistema di ricombinazione nell&#39;host. </li><li> Usare immediatamente i campioni o conservarli a -20 ° C. </li></ol></li><li> Costruzione tramite montaggio senza soluzione di continuità <ol><li> Progettare e ordinare oligonucleotidi per amplificazione PCR. NOTA: La 3&#39;estremità dell&#39;oligonucleotide contiene la sequenza terminale della parte del DNA e la 5&#39;estremità dell&#39;oligonucleotide contiene il terminale della sequenza lineare di vettori standard C-Brick ( cioè &quot;CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC&quot; per il 5 &#39; -end del filo in avanti e &quot;CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC&quot; per la 5&#39;-estremità del filo inverso). Esempi specifici possono essere trovati in uno studio precedente 4 . </li><li> Riposizionare l&#39;individuoOligonucleotidi in acqua ultra-pura ad una concentrazione di 10 μM. </li><li> Impostare reazioni PCR sul ghiaccio in un tubo PCR da 0,2 ml: aggiungere 18 μl di acqua ultra-pura, 25 μL di tampone 2x PCR, 1 μL di dNTPs (10 μM), 2,5 μl ciascuno dei primer avanti e indietro (10 μM ) Dalla fase 2.2.2, 0,5 μL di template (20-500 ng) e 0,5 μL di DNA-polimerasi ad alta fedeltà. Assicurarsi che il volume totale sia di 50 μL. </li><li> Posizionare il tubo direttamente nel termociclatore e eseguire il programma termociclatore. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C. NOTA: Impostare il programma termociclatore su: un ciclo per 3 min a 98 ° C; 30 cicli per 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C (secondo la temperatura di additivo del primer) e 1 min (a seconda della lunghezza delle parti biologiche) a 72 ° C; E un ciclo per 10 min a 72 ° C. Tenere il campione a 16 ° C. </li><li> Purificare il prodotto PCR utilizzando un sistema di pulizia PCRKit kit; Seguire il protocollo del produttore. </li><li> Digestare il vettore standard C-Brick con BamHI: aggiungere 34 μL di acqua ultra-pura, 10 μl di plasmide (1 μg), 5 μl di tampone da 10 volte e 1 μL di BamHI nel tubo di microcentrifuga. Incubare fino a 2 ore a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Purificare il prodotto sopra usando un kit di sistema di pulizia del gel; Seguire il protocollo del produttore. </li><li> Aggiungere 2 μL di vettore linearizzato (50 ng) dal punto 2.2.7, 5 μL di frammento (200 ng) dalla fase 2.2.4, 2 μl di tampone di assemblaggio senza saldatura da 5x e 1 μl di enzima di assemblaggio senza soluzione di continuità da un kit di montaggio senza soluzione di continuità A un tubo da 1,5 ml di microcentrifuga. Assicurarsi che il volume totale sia di 10 μL. </li><li> Mettere questo in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C per 30 minuti. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C. </li></ol></li><li> Costruzione tramite la digestione mediata da restrizione enzimatica e legatura ligasi mediata da T4 DNA. NOTA: Per le parti ottenute dai criteri BioBrick (passo 2.3.4-2.3.7) e BglBrick (passo 2.3.1-2.3.3), la digestione con enzimi-restrizione e la legatura ligasi mediata con T4 DNA può essere utilizzata per inserire Parti biologiche in un vettore standard C-Brick. <ol><li> Digestare le parti standard di BglBrick con BamHI e BglII: aggiungere 34 μL di acqua ultra-pura, 10 μl di plasmide (2 μg), 5 μl di tampone 10x, 0,5 μL di BamHI e 0,5 μL di BglII nel tubo di microcentrifuga. Incubare per 2 ore in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C. </li><li> Eseguire un&#39;elettroforesi con gel agarosico del 1% e purificare il frammento utilizzando un kit di sistema di pulizia del gel. </li><li> Legare il frammento e il vettore standard C-Brick: aggiungere il volume da 2 μL di vettore linearizzato (50 ng) dalla fase 2.1.12 e 6 μl di frammento (200 ng) dal punto 2.3.3 in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere 1 μl di 10 x T4 DNA ligase buffer e 1 μl di T4 DNA ligasi. Incubare per 2 ore a 22 ° C. Usare immediatamente i campioni o congelareE conservarli a -20 ° C. </li><li> Digestare le parti standard di BioBrick con XbaI e SpeI: aggiungere 34 μL di acqua ultra pura, 10 μl di plasmide (2 μg), 5 μl di tampone 10 volte, 0,5 μL di XbaI e 0,5 μl di SpeI nel tubo di microcentrifuga. Incubare per 2 ore in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C. </li><li> Digestare il vettore standard C-Brick con XbaI e SpeI: aggiungere 34 μL di acqua ultra-pura, 10 μL di plasmide (1 μg), 5 μl di tampone 10 volte, 0,5 μL di XbaI e 0,5 μL di SpeI al tubo di microcentrifuga . Incubare per 2 ore in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C. </li><li> Eseguire un&#39;elettroforesi del gel agarosico del 1% e purificare il frammento dalla fase 2.3.4 e il vettore linearizzato dal punto 2.3.5 con un kit di sistema di pulizia del gel; Seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Legare il frammento e il vettore Crick Brick: aggiungere 2 μL di vettore linearizzato (50 ng) dal punto 2.3.5 e 6 μL di frammento (200 ng) dalla fase 2.3.4 in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Anno DominiD 1 μl di 10 volte T4 DNA ligase buffer e 1 μl di T4 DNA ligasi. Incubare per 2 ore a 22 ° C. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C. </li></ol></li><li> Aggiungere 10 μL dei prodotti della fase 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 o 2.3.7 per la trasformazione chimica nelle cellule competenti di E. coli (DH10B). </li><li> Raccogliere diversi cloni in un tubo di liquido Luria-Bertani (LB) da 5 ml e incubare a 37 ° C su un agitatore (220 rpm) durante la notte. </li><li> Estrarre il plasmide usando un kit di preparazione del plasmide; Seguire il protocollo del produttore. </li><li> Identificare i cloni corretti da sequenziamento di Sanger 11 . </li></ol> 3. C-Brick Assembly ( Figura 2 ) <ol><li> Digestione del vettore C-Brick con Cpf1 <ol><li> Aggiungere 22,5 μL di acqua priva di RNasi, 4 μl di tampone Cpfl 10 volte, 10 μL del plasmide della fase 2.6 (1 μg), 0,5 μL di RRI e 1 &amp;# 181; L di Cpf1 (5 μM) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. NOTA: Cpf1 può essere acquistato in commercio o purificato seguendo il protocollo in uno studio precedente 4 . </li><li> Per inserire un frammento di DNA straniero nei siti T1 e T2, aggiungere 1 μL di crRNA-T2 (10 μM) e incubare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 30 min. A dd 1 μL di crRNA-T1 (10 μM) e Cpf1 (5 μM) per altri 30 min. NOTA: In alternativa, per inserire un frammento di DNA straniero nei siti T3 e T4, aggiungere 1 μL di crRNA-T3 (10 μM) e incubare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 30 min. Aggiungere 1 μL di crRNA-T4 (10 μM) per altri 30 min. </li><li> Aggiungere 1 μl di fosfatasi alcalina termosensiva e incubare il tubo in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C per altri 1 h. </li><li> Eseguire un&#39;elettroforesi con gel agarosio e purificare il vettore utilizzando un kit di sistema di pulizia del gel. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C. </li></ol></li&gt; <li> Digestione del frammento di DNA con Cpf1 <ol><li> Aggiungere 21 μl di acqua senza RNasi, 4 μl di 10 volte Cpf1 tampone, 10 μl di plasmide dalla fase 2.6 (2 μg), 0,5 μL di RRI e 2 μl di Cpf1 (5 μM) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. </li><li> Per inserire un frammento di DNA straniero nei siti T1 e T2, aggiungere 1 μL di crRNA-T1 (10 μM) e 1 μL di crRNA-T3 (10 μM) e incubare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 2 ore. NOTA: In alternativa, aggiungere 1 μL di crRNA-T2 (10 μM) e 1 μL di crRNA-T4 (10 μM) e incubare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Eseguire un&#39;elettroforesi con gel agarosio e purificare il frammento utilizzando un kit di sistema di pulizia del gel. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C. </li></ol></li><li> Assemblaggio di C-mattone e ulteriore verifica <ol><li> Ligate il frammento di DNA straniero e il vettore di C-Brick: aggiungere 2 μL del vettore linearizzato (50 ng) dalla fase 3.1.4 e 6 μL del frammento DNA (200 ng) dalla fase 3.2.3 a un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere 1 μl di 10 volte T4 DNA ligase buffer e 1 μl di T4 DNA ligasi. Incubare per 2 ore a 22 ° C. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C. </li><li> Aggiungere 10 μL dei prodotti di legatura (fase 3.3.1) per la trasformazione chimica in E. coli (DH10B) -competente cellule. </li><li> Aggiungere un certo numero di cloni a un tubo liquido da 5 ml di LB e incubare per una notte su un agitatore a 220 giri / min e 37 ° C. </li><li> Estrarre il plasmide usando un kit di preparazione del plasmide; Seguire il protocollo del produttore. </li><li> Identificare i cloni corretti da sequenziamento di Sanger 11 . </li></ol></li><li> Eseguire un nuovo ciclo di C-Brick assembly. I cloni corretti dal punto 3.3.4 possono essere utilizzati come un nuovo vettore C-Brick o parte del DNA per ulteriori successivi iterative C-Brick, seguendo lo stesso protocollo dai passaggi 3.1-3.3. NOTA: T2 &#39;e T3&#39; sSono progettati come il backup dei siti T2 e T3 ( Figura 1a ). Per i plasmidi ottenuti dalla fase 2.3.7, solo il T2 &#39;e il T3&#39; possono essere utilizzati per l&#39;assemblaggio standard C-Brick. </li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Questo protocollo descrive una procedura per lo standard di assemblaggio del DNA C-Brick. Il passo più importante in questo protocollo è la linearizzazione del vettore standard C-Brick; La scissione incompleta del vettore potrebbe influenzare seriamente il tasso di successo. Inoltre, sebbene Cpf1 praticamente abbia sequenze di DNA bersaglio nel pattern di scissione &quot;18-23&quot;, è stata rilevata anche una scissione inesatta vicino alle due basi 4 , che possono causare un piccolo numero di...

La standardizzazione delle parti biologiche del DNA è importante per lo sviluppo della biologia sintetica 1 . Lo sviluppo di una procedura di assemblaggio del DNA può sostituire disegni sperimentali ad hoc e rimuovere molti dei risultati imprevisti che si verificano durante l&#39;assemblaggio di componenti genetici in sistemi più grandi. Lo standard BioBrick (BBF RFC 10) è stato uno dei più antichi standard di assemblaggio del DNA proposto. Utilizza la sequenza di prefisso (contenente i siti di taglio EcoRI e XbaI) e la sequenza di suffisso (contenente siti di taglio SpeI e PstI) 2 , 3 . Poiché XbaI e SpeI hanno finiti complementari coesivi, le parti del DNA di BioBrick che vengono tagliate con XbaI e SpeI possono essere unite insieme, generando un nuovo BioBrick per un ulteriore assemblaggio iterativo. Alcuni difetti sono stati identificati con l&#39;uso dello standard BioBrick 4 . Ad esempio, produce una cicatrice da 8 bpTra le parti del DNA, che non consentono la costruzione di proteine ​​in fusione. Inoltre, i quattro tipi di restrizione a 6 bp di cui sopra devono essere rimossi dalle parti del DNA, che è molto scomodo. Lo standard BglBrick è stato creato per risolvere il primo problema 5 . Crea una cicatrice a 6 bp &quot;GGATCT&quot;, che produce Gly-Ser e consente la fusione di più proteine ​​o domini proteici. IBrick è stato sviluppato per affrontare il secondo problema 6 . Utilizza endonucleasi di homing (HEs) che riconoscono lunghe sequenze di DNA. Poiché i siti di riconoscimento HE raramente esistono nelle sequenze di DNA naturali, lo standard iBrick può essere utilizzato per la costruzione diretta di parti iBrick senza modificarne le sequenze di DNA. Tuttavia, lo standard iBrick lascia una cicatrice di 21 bp tra le parti del DNA, che potrebbe essere il motivo della sua impopolarità. Negli ultimi anni, i cluster regolarmente hanno interspato brevi ripetizioni palindromiche (CRISPR) ha sviluppato rapidamente 7 , 8 . Tra le proteine ​​associate a CRISPR (Cas), l&#39;endonucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes è ora ampiamente utilizzata. Esso presenta per lo più due interruzioni di DNA a doppio filamento (DSB) con estremità lisce 9 . Nel 2015, Zhang e colleghi hanno caratterizzato per la prima volta Cpf1 (CRISPR da Prevotella e Francisella 1). Appartiene al sistema CRISPR-Cas di classe 2 di tipo V ed è un CRISRP RNA (crRNA) -guardato endonucleasi 10 . A differenza di Cas9, Cpf1 introduce un DSB con 4 o 5 nt 5 &#39;overhang 10 . Sulla base di questa caratteristica, Cpf1 è stato utilizzato per sviluppare uno standard di assemblaggio del DNA, C-Brick 4 . Su un vettore standard C-Brick, quattro siti target Cpf1 di prefissati T1 / T2 e suffixed T3 / T4 fianco le parti biologiche; Questo è simile allo standard BioBrick. Come la scissione dei siti T2 e T3 pGenera estremità appiccicose complementari, è possibile eseguire l&#39;assemblaggio iterativo delle parti del DNA, generando una cicatrice &quot;GGATCC&quot; tra le parti. In particolare, lo standard C-Brick ha due vantaggi principali: riconoscere lunghe sequenze di bersagli e lasciare brevi cicatrici. La cicatrice a 6 bp &quot;GGATCC&quot; generata da C-Brick codifica Gly-Ser, che consente la costruzione di proteine ​​di fusione. Inoltre, lo standard C-Brick è parzialmente compatibile con gli standard BglBrick e BioBrick.

<table><tbody><tr><td>Comercial Oligonucleotide</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Taq PCR Buffer</td><td>Transgen</td><td>#J40928</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>5x RNA Transcription Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0441</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EP0111</td><td></td></tr><tr><td>NTP mixture</td><td>Sangon</td><td>#ND0056</td><td></td></tr><tr><td>RRI (Recombinant RNase Inhibitor)</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nano-Drop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>2x Phanta Max Buffer</td><td>Vazyme</td><td>PB505</td><td>PCR buffer</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Transgen</td><td>AD101</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Vazyme</td><td>P505-d1</td><td></td></tr><tr><td>Ezmax for One-step Cloning</td><td>Tolobio</td><td>24303-1</td><td>seamless assembly kit</td></tr><tr><td>5x Buffer for Ezmax One-step Cloning</td><td>Tolobio</td><td>32006</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>#R0136L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>#R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>#R0144L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>#R0145L</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>NEB</td><td>#R3133L</td><td></td></tr><tr><td>10x Buffer 3</td><td>NEB</td><td>#B7003S</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase Buffer</td><td>Tolobio</td><td>32002</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Tolobio</td><td>32206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Tolobio</td><td>32210</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>#R01762</td><td></td></tr><tr><td>SV Gel and PCR clean-up system</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Mini Kit I</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>plasmid preparation kit</td></tr><tr><td>thermosensitive alkaline phosphatase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EF0651</td><td>FastAP</td></tr><tr><td>10x Cpf1 buffer</td><td>Tolobio</td><td>32008</td><td></td></tr><tr><td>Cpf1</td><td>Tolobio</td><td>32105</td><td>FnCpf1</td></tr><tr><td>thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>veriti 96 well</td><td></td></tr><tr><td>C-Brick standard vector</td><td>Tolobio</td><td>98101</td><td></td></tr><tr><td>E. coli [DH10B]</td><td>Invitrogen</td><td>18297010</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (tryptone)</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (yeast extract)</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (NaCl)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B126BA0007</td><td></td></tr></tbody></table>

protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1

La proteina Cpf1 associata a CRISPR fila il DNA a doppio filamento sotto la guida di CRISPR RNA (crRNA), generando estremità appiccicose. A causa di questa caratteristica, Cpf1 è stato utilizzato per la creazione di un sistema di assemblaggio del DNA chiamato C-Brick, che ha il vantaggio di lunghi siti di riconoscimento e brevi cicatrici. Su un vettore standard C-Brick, ci sono quattro siti di riconoscimento Cpf1 - il prefisso (siti T1 e T2) e il suffisso (siti T3 e T4) - parti del DNA biologico flanking. La scissione dei siti T2 e T3 produce estremità appiccicose complementari, che consentono l&#39;assemblaggio di parti del DNA con i siti T2 e T3. Nel frattempo, una breve cicatrice &quot;GGATCC&quot; viene generata tra le parti dopo l&#39;assemblaggio. Poichè il plasmide appena costituito contiene ancora i quattro siti di scissione di Cpf1, il metodo consente l&#39;assemblaggio iterativo di parti del DNA, che è simile a quello di standard BioBrick e BglBrick. Una procedura che descrive l&#39;utilizzo dello standard C-Brick per assemblare parti del DNAÈ descritto qui. Lo standard C-Brick può essere ampiamente usato da scienziati, laureati e studenti universitari, e anche dilettanti.

<html> Questo protocollo ha dimostrato l&#39;assemblaggio di tre cassette di cromoproteine ​​(cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) e amilGFP (BBa_K592010)). In primo luogo, le sequenze di codificazione dei tre geni e terminatori sopra menzionati sono stati clonati individualmente in un vettore standard C-Brick. Brevi parti del DNA, promotore e terminatore, sono state introdotte nel vettore C-Brick mediante amplificazione PCR utilizzando primer contenenti le parti corte del DNA ...

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Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

La proteina Cpf1 associata a CRISPR può essere guidata da un CRISPR RNA (crRNA) appositamente progettato per separare il DNA a doppio filamento nei siti desiderati, generando estremità appiccicose. Sulla base di questa caratteristica, è stato stabilito un standard di assemblaggio del DNA (C-Brick) e qui viene descritto un protocollo che descrive il suo utilizzo.

Protocolli per l&#39;assemblaggio standard di DNA C-Brick utilizzando Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

8.2K Views.  Chinese Academy of Sciences.  La proteina Cpf1 associata a CRISPR può essere guidata da un CRISPR RNA (crRNA) appositamente progettato per separare il DNA a doppio filamento nei siti desiderati, generando estremità appiccicose. Sulla base di questa caratteristica, è stato stabilito un standard di assemblaggio del DNA (C-Brick) e qui viene descritto un protocollo che descrive il suo utilizzo. 

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A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Un Toolkit per permettere la conversione di idrocarburi in ambienti acquosi

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Ricerca

Bioingegneria

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic engineering became applicable to a large range of systems. Moreover, many transcriptional and epigenomic engineering approaches are now generally feasible for the first time. One reason for the broad applicability of CRISPR lies in its bipartite nature. Small gRNAs determine the genomic targets of the complex, variants of the protein Cas9, and the local molecular consequences. However, many CRISPR approaches depend on the simultaneous delivery of multiple gRNAs into individual cells. Here, we present a customizable protocol for string assembly gRNA cloning (STAgR), a method that allows the simple, fast and efficient generation of multiplexed gRNA expression vectors in a single cloning step. STAgR is cost-effective, since (in this protocol) the individual targeting sequences are introduced by short overhang primers while the long DNA templates of the gRNA expression cassettes can be re-used multiple times. Moreover, STAgR allows single step incorporation of a large number of gRNAs, as well as combinations of different gRNA variants, vectors and promoters.

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

Here, we present string assembly gRNA cloning (STAgR), a method to easily multiplex gRNA vectors for CRISPR/Cas9 approaches. STAgR makes gRNA multiplexing simple, efficient and customizable.

Un protocollo personalizzabile per String Assembly gRNA clonazione (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Genetica

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

Motivi di DNA stabile, 1D e 2D nanostrutture costruito da molecole di DNA circolare piccola

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Chimica

Cattura della conformazione cromosomica (3C) per la ricerca e l'insegnamento universitari

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Autore in primo piano: Ottenere una A con le 3C: Acquisizione della conformazione cromosomica per gli studenti universitari  

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

Ottenere una A con le 3C: cattura della conformazione cromosomica per gli studenti universitari

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatizzato robot Liquid Handling Assembly di dispositivi modulari del DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Biologia

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure. Each chromosome occupies a specific territory, that may change according to stage of development or cell cycle. Gene expression can occur in specialized transcriptional factories where chromatin segments may loop out from various chromosome territories, leading to co-localization of DNA segments which may exist on different chromosomes or far apart on the same chromosome. The Associated Chromosome Trap (ACT) assay provides an effective methodology to identify these long-range DNA associations in an unbiased fashion by extending and modifying the chromosome conformation capture technique. The ACT assay makes it possible for us to investigate mechanisms of transcriptional regulation in trans, and can help explain the relationship of nuclear architecture to gene expression in normal physiology and during disease states.

The associated chromosome trap (ACT) assay is a novel unbiased method for identifying long-range DNA interactions. The characterization of long range DNA interactions will allow us to determine the relationship of nuclear architecture to gene expression in both normal physiology and in diseased states.

Cromosoma Trappola associate per identificare interazioni a lungo raggio del DNA

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

Protocolli per l'assemblaggio standard di DNA C-Brick utilizzando Cpf1

Riepilogo

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Un Toolkit per permettere la conversione di idrocarburi in ambienti acquosi

Un protocollo personalizzabile per String Assembly gRNA clonazione (STAgR)

Motivi di DNA stabile, 1D e 2D nanostrutture costruito da molecole di DNA circolare piccola

Ottenere una A con le 3C: cattura della conformazione cromosomica per gli studenti universitari

Ottenere una A con le 3C: cattura della conformazione cromosomica per gli studenti universitari

Ottenere una A con le 3C: cattura della conformazione cromosomica per gli studenti universitari

Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

Automatizzato robot Liquid Handling Assembly di dispositivi modulari del DNA

Hi-C: un metodo per studiare l'architettura tridimensionale dei genomi.

Cromosoma Trappola associate per identificare interazioni a lungo raggio del DNA