Le interazioni leucocita-cellula endoteliale svolgono un ruolo importante nelle malattie infiammatorie come la sepsi. La disregolazione dell'infiammazione spesso causa un'alterata funzione di barriera dell'endotelio vascolare e un eccessivo traffico di leucociti, che può causare danni agli organi. Il saggio microfluidico biomimetico, quello che chiamiamo bMFA, riproduce la topografia e le condizioni di flusso delle reti microvascolari in vivo e consente la valutazione in tempo reale del rotolamento, dell'adesione ferma, della diffusione e della migrazione dei neutrofili nel compartimento tissutale.
Un punto di forza del test microfluidico biomimetico è la capacità di utilizzare cellule umane primarie e campioni di pazienti clinicamente rilevanti per aumentare la traduzione clinica e vagliare rapidamente potenziali terapie. A dimostrare le procedure sarà il signor Qingliang Yang, un assistente di ricerca laureato del mio laboratorio. Iniziare a inserire il tubo di circa un pollice di lunghezza all'interno delle porte utilizzando una pinza fine, ad eccezione di una porta di ingresso.
Utilizzando morsetti a mascella, bloccare le due porte di uscita e il compartimento del tessuto insieme. Diluire la soluzione madre di fibronectina a 100 microgrammi per millilitro con PBS. Caricare una siringa da un millilitro collegata a un ago smussato calibro 24 con la soluzione di fibronectina diluita e collegare la siringa a un tubo lungo quattro pollici.
Inserire il tubo nella porta di ingresso aperta, quindi spingere lo stantuffo fino a quando la fibronectina umana non viene rilasciata da un'altra porta di ingresso e bloccarla. Ripetere il processo per le porte rimanenti fino a quando tutti i canali, il compartimento tissutale e il tubo sono riempiti con la soluzione di fibronectina umana. Rimuovere l'ago ma mantenere il tubo lungo quattro pollici inserito e sbloccato.
Per eseguire il degasaggio, collegare il tubo non clamorato al primer pneumatico collegato a un serbatoio di azoto compresso con una pressione di cinque libbre per pollice quadrato per 15 minuti. Al microscopio, verificare che non vi siano bolle d'aria intrappolate all'interno del canale o del compartimento tissutale e ricollegare il dispositivo se sono presenti bolle d'aria. Rimuovere il dispositivo dal primer pneumatico e incubarlo a 37 gradi Celsius per un'ora.
Utilizzando terreni di coltura cellulare endoteliale microvascolare polmonare umano preriscaldati, lavare tutti i canali e il compartimento tissutale. Dopo aver raccolto le cellule endoteliali come descritto nel manoscritto di testo, pellettare le cellule mediante centrifugazione per cinque minuti a 150 volte G.In pompa a siringa programmabile, montare una siringa da un millilitro e attaccare il tubo all'ago smussato. Aspirare circa 20 microlitri della sospensione cellulare nel tubo senza lasciarlo entrare nella canna della siringa.
Rimuovere il morsetto dalla porta di uscita del dispositivo. Collegare il tubo alla porta di ingresso senza introdurre alcuna bolla d'aria nel canale. Arrestare la pompa con una portata da quattro a otto microlitri al minuto e osservare al microscopio.
Arrestare la pompa quando i canali sono pieni di celle. Bloccare l'uscita e tagliare il tubo di ingresso. Posizionare il dispositivo nell'incubatore per quattro ore al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius.
Dopo quattro ore di incubazione, preparare un'altra siringa e riempirla con terreni di coltura cellulare freschi. Montare la siringa in una pompa a siringa e collegarla alla porta di ingresso. Rimuovere il morsetto dalla porta di uscita.
Passare il supporto fresco attraverso il dispositivo per circa cinque minuti a quattro-otto microlitri al minuto per rimuovere le cellule galleggianti o non attaccate. Preparare una siringa riempiendola con terreni di coltura cellulare freschi. Montare la siringa in una pompa a siringa e collegarla a una porta di ingresso mantenendo aperta la porta di uscita.
Posizionare il dispositivo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Programmare la pompa a siringa per la coltivazione di cellule endoteliali sotto flusso come descritto nel manoscritto di testo. Utilizzando un microscopio, controllare bMFA dopo 48 ore di coltura sotto flusso.
La microscopia confocale ha indicato che tutte le superfici dei canali vascolari erano coperte da cellule endoteliali, formando un lume 3D completo in bMFA. Dopo aver preparato tre diversi dispositivi bMFA, caricare tre siringhe da un millilitro con terreni di coltura cellulare o TNF-alfa o TNF-alfa combinati rispettivamente con l'inibitore delta PKC, dove TNF-alfa e citochina infiammatoria viene utilizzato per stimolare le cellule endoteliali e i neutrofili. L'inibitore delta della PKC è un nuovo inibitore antinfiammatorio.
Collegare le tre siringhe caricate a tre dispositivi bMFA. Utilizzando il tampone TNF-alfa o TNF-alfa con l'aggiunta di inibitori, trattare le cellule endoteliali microvascolari polmonari umane per quattro ore a 0,1 microlitri al minuto. Dopo aver isolato i neutrofili umani come descritto nel manoscritto di testo, risospese i neutrofili in 999 microlitri di tampone HEPES e aggiungere un microlitro di soluzione madre colorante CFDA SE da 10 millimolari alla sospensione, ottenendo una soluzione di lavoro a 10 micromolari di CFDA SE e incubarla per 10 minuti a temperatura ambiente.
Lavare le cellule due volte con tampone HEPES centrifugando la soluzione per cinque minuti a 315 volte G.Dopo aver contato le cellule, risospendere a 2 milioni di neutrofili per millilitro in terreni di coltura cellulare o TNF-alfa o TNF-alfa aggiunti con inibitore delta PKC e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Riempire la siringa con un micromolare di un chemio-attrattivo, fMLP, preparato in terreni di coltura cellulare. Aprire una porta di ingresso e una porta di uscita del bMFA.
Rimuovere il tubo della porta dal compartimento del tessuto e inserire il tubo fMLP. Iniettare circa 20 microlitri di fMLP nel compartimento tissutale per tutti i bMFA, lasciando quello trattato con terreni di coltura cellulare. Tagliare il tubo e bloccarlo.
Riempire la siringa con circa 200 microlitri di sospensione per neutrofili e montare la siringa sulla pompa della siringa. Dopo aver posizionato il dispositivo su uno stadio di microscopio invertito, impostare la portata a un microlitro al minuto e avviare la pompa. Attendere che una piccola goccia della sospensione dei neutrofili esca dal tubo e inserire il tubo nella porta di ingresso.
I neutrofili marcati fluorescenti fluiscono nei canali vascolari e interagiscono con le cellule endoteliali e le condizioni di flusso fisiologicamente rilevanti. Dopo 10 minuti dall'inizio dell'esperimento, aprire il software di analisi delle immagini, impostare l'obiettivo su 10x e utilizzare il joystick del palco per centrare il dispositivo al microscopio. Per ottenere la mappa di adesione, andare su Acquisisci, fare clic su Scansione immagine grande.
Viene visualizzata una nuova finestra. Scegli Obiettivo 10x e imposta l'opzione campo, ad esempio 5 per 3. Fare clic su Scansione, fare clic su File e salvare la mappa di adesione.
Per ottenere la mappa di migrazione per l'analisi della migrazione, centrare il dispositivo al microscopio utilizzando il joystick dello stage. Fare clic su Visualizza, Controlli acquisizione, Acquisizione ND. Viene visualizzata una nuova finestra.
Impostare il percorso per salvare il file e digitare il nome del file. Controlla la funzione Immagine grande, imposta Area di scansione, ad esempio 5 per 3. Controlla la funzione Tempo, imposta l'intervallo su cinque minuti e La durata su 60 minuti.
Scatta immagini time lapse del compartimento tissutale, con un'immagine scattata ogni cinque minuti durante l'ora successiva. La simulazione CFD mostra il modello di flusso laminare nei canali vascolari, ad eccezione delle aree di biforcazione in cui il modello di flusso è disturbato. Dopo aver eseguito il test biomimetico del microfluido, le immagini di contrasto di fase hanno rivelato che le superfici dei canali vascolari erano coperte da cellule endoteliali e allineate nella direzione del flusso di taglio dopo 48 ore di coltura.
L'imaging a fluorescenza è stato effettuato utilizzando la microscopia confocale, indicando che le cellule endoteliali formano un lume tridimensionale completo in bMFA È stata ottenuta una mappa di adesione dei neutrofili, che ha rivelato che esiste un'adesione significativa dei neutrofili alle cellule endoteliali in bMFA. La mappa di migrazione dei neutrofili in bMFA ha rivelato che dopo l'attivazione del TNF-alfa, una notevole migrazione dei neutrofili avviene all'interno del compartimento tissutale, mentre tale migrazione non è stata osservata senza l'attivazione del TNF-alfa. Una mappa di adesione che correla la distribuzione spaziale dei neutrofili con la velocità di taglio ha dimostrato che l'adesione dei neutrofili si è verificata preferenzialmente in vasi con bassa velocità di taglio e vicino a regioni di biforcazione.
Inoltre, il trattamento con TNF-alfa aumenta significativamente l'adesione, che è stata inibita con l'inibitore delta PKC. L'analisi delle immagini time lapse ha indicato che l'attivazione del TNF delle cellule endoteliali aumenta la migrazione dei neutrofili in risposta alla fMLP, mentre il trattamento con l'inibitore delta PKC ha ridotto la migrazione rispetto alle cellule trattate con TNF-alfa. Pertanto, bMFA può essere utilizzato per testare l'efficacia di una nuova terapia per il trattamento della malattia infiammatoria.
Il bMFA può anche essere utilizzato per studiare l'integrità dell'endotelio misurando variabili come la permeabilità e la resistenza elettrica trans-endoteliale, ciò che viene chiamato TEER e l'espressione della molecola di adesione durante l'infiammazione. Il test microfluidico biomimetico può imitare il microambiente di diversi organi e non è limitato a singoli tipi di cellule o specie, e può anche modellare la comunicazione cellula / cellula fondamentale per la funzione degli organi e modellare diverse malattie.
