Questo lavoro è stato supportato dal NIH / NHLBI concessione R01 HL082689 a Scott I. Simon e Anthony G. Passerini.

1. Di coltura cellulare e Preparazione del substrato <ol><li> Tagliare supporti circolari da 3 pollici da una x 100 20 piatto di coltura tissutale mm (BD Falcon) usando un tornio. Sterilizzare substrati mediante immersione in etanolo al 70%. Posto in una capsula di Petri e mantello con 4 ml di collagene di tipo I (100 pg / ml) per 1 ora a temperatura ambiente, poi lavare con 4 ml 1 x PBS. </li><li> Sospendere Le cellule endoteliali aortiche (HAEC, passaggio 4-6) a 6.5x10 5 cellule / ml e di sementi mediante l&#39;applicazione di 1 ml direttamente al substrato. Posto a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore e permettere alle cellule di aderire al substrato per 1 h. </li><li> Aggiungere 9 ml di crescita endoteliale Medio-2 (EGM-2) integrato con 1x antibiotico-antimicotico soluzione alle cellule. Modificare i media ogni 2 giorni fino a quando le cellule raggiungere il 90% di confluenza. </li><li> Mantenere cellule THP-1 in mezzo RPMI 1640 integrato con 10% FBS e 1x antibiotico-antimicotico soluzione. Cellule Passage quando raggiungono una densità di 10 6 cellule / ml. </li></ol> 2. Cella Shearing protocollo Le cellule sono condizionati in un costume cono-and-piastra di dispositivo a cella Shearing (CSD). Dettagli del dispositivo e specifiche di progetto sono documentati nella Tabella 1 e Figura 4. <ol><li> Preparare il CSD. Sterilizzare l&#39;alloggiamento camera con etanolo e risciacquare con PBS sterile. Riscaldare l&#39;alloggiamento a 37 ° C e livello per assicurare che il cono è perpendicolare al monostrato cellulare. Assemblare il substrato con le cellule dal fondo del contenitore e impostare il cono all&#39;altezza desiderata. </li><li> Utilizzare Leibovitz-15 (L-15) mezzo supplementato con BulletKit Endothelial come mezzo di taglio per mantenere il pH corretto in assenza di CO 2. Per stimolare infiammazione, aggiungere fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α, 0,5 ng / ml) al mezzo di taglio e iniettare 6 ml nel dispositivo tramite una siringa collegata ad una porta di ingresso, avendo cura di non introdurre ariabolle nella camera. </li><li> Cellule di taglio ad un elevato sforzo di taglio grandezza costante (HSS, 15 dyne / cm 2) o una sollecitazione di taglio oscillatoria (OSS, 0 ± 5 dyne / cm 2, 1 Hz) per 4 ore. La SS desiderato si ottiene ruotando il cono di sopra delle celle, che è controllato con precisione con un micro-motore a passo, come precedentemente descritto 6 La parete SS in superficie (τ w) è approssimata da.: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="Equazione 1" /> dove μ è la viscosità del mezzo, ω è la velocità angolare del cono, e α è l&#39;angolo del cono (0,5 °). L&#39;allineamento cono con il substrato viene regolata entro 0,05 ° attraverso il livellamento di precisione e l&#39;altezza gap fissato a 20 ± 10 micron utilizzando un calibro di profondità per ridurre al minimo variazione circonferenziale e radiale in τ w. Il dispositivo è stato convalidato per garantire caratteristiche di flusso laminare. Rimuovere cells dal dispositivo e preparare l&#39;analisi di adesione dei monociti. </li></ol> 3. Fabbricazione di PDMS Microfluidic Camera <ol><li> Ottenere stampo master per numero di canale desiderato microfluidica e l&#39;altezza del canale a seconda dell&#39;applicazione. Le caratteristiche del disegno specifico utilizzato in questo protocollo sono dettagliati nella Tabella 1. Il metodo per creare questi è già ben documentata in letteratura. 1 In breve, la rete di canali è progettato utilizzando software CAD (Autodesk Inventor) e stampato a 5000 dpi su una trasparenza. Fotoresist negativo (SU8) viene filata su un wafer di silicio ad uno spessore di 100 um. La trasparenza è sovrapposta ed esposto alla luce UV. Non polimerizzato photoresist viene rimosso per generare la matrice positiva replica. </li><li> Per rendere la soluzione base di silicone PDMS mix con silicone agente di indurimento a 10:01 in peso in una barca a pesare e mescolare con una pipetta 5 ml sierologico. Fare attenzione a non grattare le paretidel peso della barca per evitare di aggiungere fiocchi di plastica per la soluzione. </li><li> Posizionare il wafer master in un piatto 100x15mm Petri e versare la soluzione PDMS nel piatto. </li><li> Coprire il piatto e metterla in un contenitore vuoto per 15 minuti per rimuovere le bolle. Dopo 15 minuti prendere la piastra di Petri e rimuovere le bolle in eccesso delicatamente soffiando aria sulla superficie. </li><li> Porre la capsula Petri in un forno per 1 ora a 70 ° C. Rimuovere il piatto e tagliare le camere microfluidici utilizzando una lama affilata. </li></ol> 4. Montaggio del dispositivo sul microscopio <ol><li> Accendere sorgente di luce al microscopio invertito e impostare riscaldamento a 37 ° C. Collegare il tubo di una siringa da 10 ml e riempirlo con acqua distillata in modo tale che non ci siano bolle. Posizionare la siringa nella pompa a siringa e portata impostata per indurre una parete di SS 1 dyne / cm 2. La sollecitazione di taglio parete (τ w) generata lungo la mezzeria del canale è approssimata utilizzando lo standardequazione per un parallelo-plate camera di flusso: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="Equazione 2" /> dove μ è la viscosità del mezzo, Q è la portata volumetrica, h è l&#39;altezza del canale, e w è la larghezza del canale. Nota: poiché i canali sono di larghezza finita effettivo τ w varia con w seconda del canale rapporto di aspetto, e le misurazioni vengono evitati al 25% più vicino alle pareti laterali. 1,7 </li><li> Posizionare PDMS camera in acqua e utilizzare una micropipetta 100 microlitri per rimuovere aria dai singoli canali. Collegare l&#39;alimentatore alla camera a vuoto facendo attenzione che la valvola è disattivata. </li><li> Porre Petri con monostrato HAEC rispetto all&#39;obiettivo. Posizionare la camera di PDMS sulla piastra di Petri e cautela impostato sul monostrato HAEC, assicurando che non si formano bolle d&#39;aria tra il dispositivo e il monostrato. Ruotare la valvola in modo che il vuoto è acceso e la camera è fissato saldamente. </li&gt; <li> Tagliare 19 aghi calibro smorzare tale che ci sia solo 5 mm di sinistra metallo. Riempire il serbatoio di plastica con il tampone e mettere in ingresso PDMS camera. Ripetere per appropriato numero di canali da utilizzare. Collegare il tubo dalle pompe siringa per PDMS uscite canale. </li></ol> 5. Adesione Assay monociti sotto stress Shear <ol><li> Sospensione cellule THP-1 a 2x10 6 cellule / ml in HBSS + Ca 2 + / Mg 2 + + HSA 0,1%. Attivazione cellule THP-1 mediante incubazione con stromale fattore-1 derivato (SDF-1, 50 ug / ml) per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Accendere pompa a siringa per stabilire un flusso, quindi si aggiungono 50 microlitri di sospensione cellulare al serbatoio senza introdurre bolle d&#39;aria. Quando il flusso è completamente sviluppato, iniziare l&#39;acquisizione dei dati. </li><li> Eseguire per 5 min a velocità di flusso del caso, aggiungendo tampone al serbatoio se la soluzione diventa bassa. Continuare tampone scorre nei canali per lavare le cellule non legate nella corrente di flusso. </li></ol> 6. Acquisizione dati e analisi <ol><li> Acquisire sequenze di immagini digitali a 3 fotogrammi / s per 2 min a seguito del flusso pienamente sviluppata lungo l&#39;asse longitudinale del canale a 3 posizioni nel canale, facendo attenzione a non registrare immediatamente dopo l&#39;ingresso o prima o porte di uscita 25% in più vicina al lato pareti. </li><li> Contare il numero di cellule arrestate per campo identificando loro fase aspetto brillante nello stesso piano focale del monostrato. </li><li> Cell arresto impresa è definita dal movimento &lt;cella diametro ½ in 10 s. Dati di una media di 3 campi aleatori per canale e quantificare utilizzando il software ImageJ. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Anche se l&#39;endotelio vascolare è uniformemente esposta agli agonisti che contribuiscono a infiammazione sistemica, l&#39;aterosclerosi è una malattia focale che si sviluppa preferenzialmente ai siti di disturbo del flusso nelle arterie, implicando eterogeneità spaziale in funzione endoteliale. 8 </sup&gt; mediatori circolanti infiammatorie come il TNF-α sono elevati nel siero umano in condizioni di stress metabolico e correlare con compromissione della funzione endoteliale. 9, 10, TNF-α induce una risposta ben caratterizzato in CE che include up-regolazione di molecole di adesione cellulare (CAM : ad esempio, VCAM-1, ICAM-1, E-selectina) e chemochine che reclutano monociti dal circolo, un segno distintivo della lesione aterosclerotica primi 11 emodinamica è un importante regolatore del fenotipo endoteliale infiammatoria 12 Alta tensione di taglio (HSS. magnitudo.; ad esempio 15 dyne / cm 2) o sollecitazione di taglio pulsatile (PSS, ad esempio 15 ± 5 dyne / cm 2) associati a siti di resistenza a aterosclerosi in arterie down-regolano TNF-α-risposte indotte. Al contrario, lo stress shear a bassa magnitudo (LSS: ad esempio, 2 dyne / cm 2) o di taglio oscillatoria (OSS, ad esempio 0 ± 5 dyne / cm 2), caratteristiche dei siti sensibili in vivo, esacerbare cytokine-indotta infiammazione. 13, 14 I nostri dispositivi microfluidici PDMS fornire una piattaforma per la realizzazione di studi meccanicistici per verificare ipotesi relative alla sovrapposizione di stress metabolico con i fattori idrodinamici nella regolazione della funzione endoteliale e la patologia. L&#39;utilità e la versatilità del metodo è ampiamente illustrata attraverso i seguenti risultati rappresentativi. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Shear stress modula differenziale THP-1 di adesione delle cellule al TNF-alfa monostrati infiammate endoteliali. Questi dati sono stati acquisiti utilizzando il protocollo dettagliato descritto in precedenza e documentato nel video. Monostrati HAEC sono stati esposti contemporaneamente a una bassa dose di citochina infiammatoria TNF-α (0,5 ng / ml, ~ EC 50 per VCAM-1 up-regulation) e sia HSS (15 dyne / cm 2) o OSS (0 ± 5 dynes / cm 2, 1 Hz) in un CSD personalizzato per 4 ore come descriletto nel protocollo dettagliato. THP-1 arresto cellulare è stata quantificata sotto flusso di taglio in una camera di flusso PDMS. Questa linea cellulare che imita il fenotipo di monociti umani è stato scelto per la sua riproducibilità e facilità d&#39;uso. HSS attenuato la risposta infiammatoria rispetto agli OSS, con conseguente diminuzione THP-1 arresto cellulare. I dati sono stati analizzati mediante Student t-test e sono rappresentati come media ± SEM di 3 esperimenti indipendenti. Adattato con il permesso di DeVerse et al. 5 I dati che seguono dimostrano la versatilità del nostro approccio con esempi dal nostro lavoro pubblicato. Partenze dal protocollo di cui sopra sono indicati, se del caso. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Modulazione di citochine indotta VCAM-1 e reclutamento dei monociti in un gradiente di sollecitazione di taglio. A) HAEC monostrati sono state stimolate con TNF-α (0,3 ng / ml) per 4 ore sotto flow in uno VMMC progettato sulla base Hele-Shaw teoria del flusso. 15 A decremento lineare in grandezza SS lungo l&#39;asse del canale è stato ottenuto progettando le pareti laterali della camera di coincidere con la ottimizza di un flusso due stagnazione dimensionali e di forma alla fine del canale per abbinare i iso-potenziali linee. La sollecitazione di taglio parete (τ w) generata lungo la mezzeria di questo canale ad una distanza assiale dall&#39;ingresso (x) è dato da: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="Equazione 3" /> dove μ è la viscosità del mezzo, Q è la portata volumetrica, h è l&#39;altezza del canale, w 1 è la larghezza del canale di ingresso, ed L è la lunghezza totale del canale. Q è stato scelto per generare un gradiente di grandezza da 16 SS dyne / cm 2 a monte che a 0 al punto di stagnazione &quot;a&quot; appena prossimale al outlet. B)-C), VCAM-1 espressione è stata misurata in situ tramite microscopia immunofluorescenza usando anticorpi coniugati punti quantici e presentati come percentuale di intensità di fluorescenza media (MFI) di controllo non stimolato statico. SS non modulare il livello basale di VCAM-1, che è basso in HAEC non stimolate (triangoli grigi). Tuttavia, espressione di VCAM-1 è aumentato rispetto al TNF-α a grandezze LSS, con un picco a ~ 2 dyne / cm 2 e tornare al TNF-α basale o inferiore a grandezze di taglio di 5 dyne / cm 2 (quadrati neri). D) monociti (10 6 / ml) sono stati perfusi a 2 dyne / cm 2 per 5 min in canali di flusso paralleli su monostrati precondizionati come in A). Reclutamento dei monociti all&#39;endotelio quantitativamente correlato con l&#39;espressione di VCAM-1 in un ampiezza di taglio dato stress. In particolare, la capacità di sondare espressione di VCAM-1 e il reclutamento dei monociti con fine risoluzione spaziale in un monolayer rivelato cambiamenti significativi su un range limitato in grandezza SS che non dovrebbe essere apprezzato dagli applicando valori discreti poche di taglio in esperimenti separati. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA misure ripetute e valutate differenze di Newman-Keuls posttest, * P &lt;0,05 da TNF-α in condizioni statiche. I dati sono media ± SEM di 3-6 esperimenti indipendenti. Adattato con il permesso di Tsou et al. 2 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Lipoproteine ​​ricche di trigliceridi (TGRL) modulare citochine indotta infiammazione in proporzione a livelli di trigliceridi di siero e VCAM-1 espressione. HAEC monostrati sono state stimolate con TNF-α (0,3 ng / ml) per 4 ore simultaneamente con TGRL (10 mg / dl ApoB) isolato da soggetti umani dopo un pasto ricco di grassi nella cultura statica. A) espressione di VCAM-1 è stato misurato separatamente in sospeso CE mediante citometria a flussoe adesione monociti quantificato utilizzando un VMMC come descritto nel protocollo dettagliato. I dati sono presentati come variazione% di TNF-α. Arresto Monocyte varia in proporzione diretta alla endoteliale espressione di VCAM-1, che ha aumentato direttamente con il livello di trigliceridi di siero. B) Monocyte arresto per un sottoinsieme di pro-infiammatorie donatori è abrogata in presenza di un anticorpo VCAM-1 blocco. La significatività è stata determinata la Student t-test accoppiato, significa ± SEM di 3-5 esperimenti indipendenti. Adattato con il permesso di Wang et al. 4

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P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride-rich+lipoproteins+prime+aortic+endothelium+for+an+enhanced+inflammatory+response+to+tumor+necrosis+factor-alpha.">Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha.</a> Circ. Res. 100, 381-390 (2007).</li><li>Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+inflammation+correlates+with+subject+triglycerides+and+waist+size+after+a+high-fat+meal.">Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).</li><li>Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+modulates+rage-mediated+inflammation+in+a+model+of+diabetes-induced+metabolic+stress.">Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).</li><li>Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+metabolic+disorders.">Inflammation and metabolic disorders.</a> Nature. 444, 860-867 (2006).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+atherosclerosis.">Inflammation in atherosclerosis.</a> Nature. 420, 868-874 (2002).</li><li>Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+shear+stress+and+atherosclerosis:+A+matter+of+site+specificity.">Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity.</a> Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).</li><li>Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+increases+icam-1+and+decreases+vcam-1+and+e-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-[alpha]+in+endothelial+cells.">Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).</li><li>Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells.">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).</li><li>Usami, S., Chen, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+cd11c++monocytes+in+atherogenesis+associated+with+hypercholesterolemia.">Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia.</a> Circulation. 119, 2708-2717 (2009).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Si descrivono l&#39;uso di dispositivi microfluidici PDMS per la valutazione on-chip di endoteliale fenotipo infiammatoria attraverso l&#39;imaging in tempo reale di espressione CAM e adesione monociti. Uno dei principali vantaggi del nostro approccio risiede nella capacità di quantificare i risultati associati a disfunzione endoteliale in cellule esposte a mediatori infiammatori come i lipidi alimentari e citochine in condizioni idrodinamiche definiti che rispecchiano shear stress nei vasi aterogene. Il VMMC facilitar...

<table border="1"><tbody><tr><td> Voce </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 100 x 20mm piastre di Petri </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Etanolo 95% </td><td> EMD Chemicals </td><td> EX0290-1 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Collagene di tipo I Tail derivata Rat </td><td> Gibco </td><td> A10483-01 </td></tr><tr><td> Cellule endoteliali umane aortica </td><td> Genlantis </td><td> PH30405A </td></tr><tr><td> Antibiotico-antimicotica Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> BulletKit endoteliale </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Endoteliali basali Media-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> Siringhe da 10 ml </td><td> BD Falcon </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Tubi in poliuretano </td><td> Tygon </td><td> ABW0001 </td></tr><tr><td> Leibovitz-15 supporti </td><td> Gibco </td><td> 11415-069 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Base in silicone elastomero </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 elastomero siliconico Catalizzatore </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> SU8 Photoresist Maestro Wafer </td><td> UC Davis Pan Lab </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Eclipse TE200 microscopio invertito </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE200 </td></tr><tr><td> Pompa a siringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD2000 </td></tr><tr><td> 19 gauge ago ipodermico </td><td> Kendall </td><td> 8881 </td></tr><tr><td> THP-1 linea cellulare monocitica </td><td> ATCC </td><td> TIB-202 </td></tr><tr><td> HBSS (Hanks soluzione salina tamponata) con Ca 2 + / Mg 2 + </td><td&gt; Gibco </td><td> 14025-092 </td></tr><tr><td> Fattore di Necrosi Tumorale alfa (TNF-α) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> Stromal Factor Derivato - 1 (SDF-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 350-NS-010 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040-CV </td></tr><tr><td> Albumina serica umana (HSA) </td><td> ZLB Behring </td><td> NDC 0053-7680-32 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti e attrezzature specifiche.

on-chip endothelial inflammatory phenotyping

Aterogenesi è potenziato da alterazioni metaboliche che contribuiscono ad un elevato stato di infiammazione sistemica con conseguente disfunzione endoteliale. Tuttavia, i primi cambiamenti funzionali dell&#39;endotelio che indicano il livello individuale di rischio non sono direttamente valutato clinicamente per aiutare strategia terapeutica guida. Inoltre, la regolazione di infiammazione emodinamica locali contribuisce alla non casuale distribuzione spaziale di aterosclerosi, ma i meccanismi sono difficili da delineare in vivo. Descriviamo un approccio lab-on-a-chip basato su test di quantitativamente perturbazione metabolica di eventi infiammatori nelle cellule endoteliali umane (CE) e dei monociti in condizioni di flusso precise. Metodi standard di litografia soft sono usati per microfabricate vascolari camere mimetici microfluidica (VMMC), che sono legati direttamente alla coltura monostrati CE. 1 Questi dispositivi hanno il vantaggio di utilizzare piccoli volumi di reagenti, mentrefornendo una piattaforma per l&#39;imaging direttamente gli eventi infiammatori a livello della membrana di CE esposto ad un ben definito campo di taglio. Abbiamo applicato con successo questi dispositivi per indagare citochine, lipidi 2-3, 4 e 5 RAGE indotta infiammazione in umano aortica CE (HAEC). Qui documentare l&#39;uso della cella VMMC di dosaggio monocitiche (THP-1) laminazione e arresto su monostrati HAEC che sono condizionati alle caratteristiche di taglio differenziali e attivato dalla citochina infiammatoria TNF-α. Studi come questi stanno fornendo informazioni meccanicistica in atherosusceptibility in caso di fattori di rischio metabolici.

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On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Camere di flusso Microfluidic incisi da fotolitografia e fabbricati da PDMS sono applicate per sondare gli esiti funzionali associati alla disfunzione CE e l&#39;infiammazione. In un esperimento rappresentativo, la capacità di sforzo di taglio differenziale di modulare l&#39;adesione cellulare monocitica di citochina attivato CE monostrati è dimostrata.

On-Chip Fenotipizzazione Endothelial infiammatoria

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

on-chip-endothelial-inflammatory-phenotyping

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K Views.  University of California, Davis. Camere di flusso Microfluidic incisi da fotolitografia e fabbricati da PDMS sono applicate per sondare gli esiti funzionali associati alla disfunzione CE e l'infiammazione. In un esperimento rappresentativo, la capacità di sforzo di taglio differenziale di modulare l'adesione cellulare monocitica di citochina attivato CE monostrati è dimostrata.

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On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

On-Chip Isotachophoresis per separazione degli ioni e purificazione di acidi nucleici

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Ricerca

Bioingegneria

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree On-chip Tomographic Microscopia Utilizzando Multi-angolo di illuminazione e Pixel Super-risoluzione

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantificare le proprietà meccaniche del glicocalice endoteliale con microscopia a forza atomica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. The feasibility of using magnetic forces to capture and retain endothelial outgrowth cells (EOC) labeled with super paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) has been shown previously. But this technique requires the development of a mechanically functional stent from a magnetic and biocompatible material followed by in-vitro and in-vivo testing to prove rapid endothelialization. We developed a weakly ferromagnetic stent from 2205 duplex stainless steel using computer aided design (CAD) and its design was further refined using finite element analysis (FEA). The final design of the stent exhibited a principal strain below the fracture limit of the material during mechanical crimping and expansion. One hundred stents were manufactured and a subset of them was used for mechanical testing, retained magnetic field measurements, in-vitro cell capture studies, and in-vivo implantation studies. Ten stents were tested for deployment to verify if they sustained crimping and expansion cycle without failure. Another 10 stents were magnetized using a strong neodymium magnet and their retained magnetic field was measured. The stents showed that the retained magnetism was sufficient to capture SPION-labeled EOC in our in-vitro studies. SPION-labeled EOC capture and retention was verified in large animal models by implanting 1 magnetized stent and 1 non-magnetized control stent in each of 4 pigs. The stented arteries were explanted after 7 days and analyzed histologically. The weakly magnetic stents developed in this study were capable of attracting and retaining SPION-labeled endothelial cells which can promote rapid healing.

Our goals were to design, manufacture and test ferromagnetic stents for endothelial cell capture. Ten stents were tested for fracture and 10 more stents were tested for retained magnetism. Finally, 10 stents were tested in-vitro and 8 more stents were implanted in 4 pigs to show cell capture and retention.

Bare Metal Stent ferromagnetico per Capture cellule endoteliali e conservazione

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Film secco basati su Photoresist biosensore elettrochimico Microfluidic Platform: Fabbricazione di dispositivi, saggio su chip preparazione e funzionamento del sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabbricazione e validazione di un sistema di organo-on-chip con elettrodi integrati direttamente quantificare transendoteliale resistenza elettrica

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Phenotipizzazione del ceppo di lievito ad alta velocità effettiva con sequenziamento dell'RNA basato su droplet

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

Biostampa diretta di Sferoidi mammari multicellulari 3D su reti endoteliali

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood

Caratterizzazione delle cellule endoteliali di escrescenza del sangue (BOEC) dal sangue periferico suino

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Un sistema microfisiologico per studiare l'interazione leucocitaria-cellula endoteliale durante l'infiammazione

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...