La ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Eye Institute dei National Institutes of Health di cui ai numeri di aggiudicazione: R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) e P30EY014104. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Ulteriore supporto è stato fornito dal Fondo Massachusetts Lions Eye Research (KMC) e un premio speciale dal Research Scholar per prevenire la cecità (a KMC).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati trattati in conformità con l&#39;Associazione per la Ricerca e la Visione e Oftalmologia Dichiarazione per l&#39;uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e le linee guida e regolamenti stabiliti dal Massachusetts Eye and Ear Infirmary Comitato Animal Care. Il giorno prima dell&#39;esperimento: 1. Preparazione di tubi per camera di flusso <ol><li> Per preparare il lato giugulare, collegare 1 centimetro PE10 tubo di polietilene per tubi di silicio 6 centimetri seguita da tubo di polietilene 5 centimetri. Per il lato carotide, preparare in modo simile al lato giugulare con l&#39;aggiunta di un tubo a T nel tubo di silicio 6 centimetri circa 1,5 cm di distanza dal tubo di polietilene da 1 cm (Figura 1A, B). Per inserire il tubo a T, allargare il tubo in silicone utilizzando una pinza sottile se necessario. </li><li> Collegare un&#39;estremità di 10 cm di tubo in silicone al trasduttore di pressione poi inserire l&#39;estremità T della carotide side T-tube nell&#39;altra estremità. Assicurarsi che il collegamento siti sono stretti e perdite. Applicare un piccolo pezzo rettangolare di parafilm su dove il tubo adatta insieme, se necessario, per impedire la perdita (Figura 1C). </li></ol> 2. Rivestimento della Camera <ol><li> Preparare la proteina di rivestimento endoteliale (ad esempio, P selectina, ICAM-1 (ICAM-1), vascolari proteina-1 di adesione cellulare (VCAM-1)) in 0,1% BSA. Come linea guida, 1 mg di proteina in 200 ml BSA è sufficiente per ricoprire 4-5 camere. Usando una siringa da 1 ml collegato ad un ago 25 G, infondere ciascuna camera (0,04 x 0,4 x 50 mm) con proteine ​​rivestimento endoteliale. Conservare le camere rivestite in una provetta da 15 ml a 4 ° C durante la notte. </li></ol> Il giorno dell&#39;esperimento: 3. Preparare la Camera <ol><li> Rimuovere le camere rivestite da 4 ° C e collegare il tubo giugulare e carotide per ogni lato. Sigillare le connections allungando con attenzione un piccolo pezzo rettangolare di parafilm su dove il tubo incontra la camera. Utilizzando una siringa, riempire la camera e il tubo con il 0,1% di BSA (controllo delle perdite). Incubare per 45 min. </li><li> Preparare un piatto 35 millimetri Petri per contenere la camera tagliando tacche su ciascun lato del piatto. Stabilizzare la camera in tacche; quindi utilizzare una piccola goccia di silicone per apporre la camera al piatto al sito dentata. Assicurarsi che la camera sia in piano, cercando al microscopio. Lasciare che il silicone asciugare per almeno 15 minuti. </li><li> Riempire una siringa da 60 ml di bloccaggio con eparina e collegarsi al trasduttore di pressione. Collegare il trasduttore di pressione al tubo carotide nel seguente ordine: trasduttore, tubo in silicone, e T-tubo. <ol><li> Utilizzare un PE50 1 cm tra il tubo in silicone collegato al trasduttore e il tubo a T per fissare il collegamento. Passare il tubo in silicone carotide attraverso il morsetto pressione (Figura 1D). Eseguire 100USP eparina through il tubo e la camera fino a quando non ci siano bolle d&#39;aria. </li></ol></li></ol> 4. Configurazione del Software <ol><li> Per preparare il software, accendere il computer, microscopio, e il dispositivo di laboratorio aperto. Fare doppio clic sulla suite di applicazioni Leica (LAS) (o equivalente) e preparare una cartella in cui salvare il video: sfogliare → → acquisire film → definire sequenza di clip (clip = 15, tempo di registrazione = 30 sec, e gli intervalli = 15 sec) quindi fare clic sul segno &quot;+&quot; per confermare. </li><li> Per registrare la pressione del flusso aprire il LabChart (o equivalente) di file e coordinare il nome del file nella cartella di registrazione nella fase 4.1, sopra. </li></ol> 5. Procedura chirurgica <ol><li> Anestetizzare un 8-10 settimane di età mouse utilizzando una combinazione di ketamina (60 mg / kg) e xilazina (6 mg / kg) iniettata intra-peritoneally (IP). Verificare che la sedazione profonda viene raggiunto entro 5-10 minuti dalla perdita di recesso pedale reflex. Se necessario, isofluranodistribuito mediante maschera facciale può essere somministrato come necessario. </li><li> Mentre in anestesia, posizionare un pad riscaldamento sotto la gabbia e impostare a 37 ° C per mantenere la temperatura corporea. Una volta che l&#39;anestesia corretta è confermato, posizionare il mouse in una posizione ventrale e cappotto gli occhi con bacitracina unguento per prevenire la secchezza oculare. </li><li> Successivamente, radersi i capelli al sito di incisione con una lama di rasoio e pulire accuratamente il sito con l&#39;alcol. </li><li> Una volta completamente anestetizzato fissare l&#39;animale con nastro mantenere il mouse in posizione ventrale. Esporre la zona del collo con le forbici e rimuovere la ghiandola tiroidea per esporre la trachea e navi (Figura 2A). </li><li> Pulire la carotide finché non è completamente esposto facendo attenzione a non danneggiare il nervo vago (Figura 2B). Piegare un pezzo di sutura e superare la curva sotto la carotide poi tagliare alla curva così ora ci sono 2 pezzi di sutura sotto la carotide. Loop ogni sutura in nodi (non stringere lanodi). </li><li> Ripetere la stessa procedura per esporre la vena giugulare sinistra (Figura 2C), preparazione delle suture nello stesso modo (Figura 2D). </li><li> Collegare il tubo alla vascolarizzazione del mouse. <ol><li> Eparinizzare il mouse iniettando 1 ml di eparina IP. </li><li> Serrare la sutura superiore sulla carotide. Posizionare il morsetto nave a partire da esso può andare sulla carotide (Figura 3A). Utilizzare pinze per tenere l&#39;arteria dalla sutura superiore e fare una piccola incisione, circa 1/8 della circonferenza dell&#39;arteria, utilizzando i microscissors (Figura 3B). </li><li> Passare il tubo carotide attraverso il secondo nodo nella sutura superiore e nella incisione fatta nell&#39;arteria. Tie off sutura inferiore in modo che l&#39;arteria è sigillata attorno al tubo (diversi nodi devono essere effettuate per garantire una tenuta stagna; la figura 3C). </li><li> Ripetere la stessa procedura per inserire il tubo vena giugulare (navemorsetto non è necessaria per il lato giugulare; Figura 3D). </li><li> Controllare la portata rilasciando il morsetto nave. Se non ci sono perdite di muovere il mouse per il microscopio e collegare il tubo carotide e della vena giugulare per il tubo della camera (vedi video allegato per la dimostrazione di intervento chirurgico). </li></ol></li></ol> 6. Registrazione di rotolamento Velocity <ol><li> Aprire il morsetto carotide per riempire la camera, rendendo un circuito con il sistema circolatorio del mouse. Lasciare il sangue di circolare per 3-5 minuti in modo che le condizioni di flusso stabilizzano. Durante il periodo di attesa di 3-5 min, regolare la fase di microscopio in modo che la camera è a partire da un&#39;estremità all&#39;altra con l&#39;obiettivo microscopio ed il suo bordo è parallelo alla finestra di registrazione video sullo schermo. </li><li> Riempire il piatto Petri modificato contenente la camera di vetro con acqua quindi abbassare l&#39;obiettivo 10X immersione in acqua nel piatto in modo che le cellule che scorre attraverso la camera sono visibili.L&#39;intensità della luce può essere regolato per un&#39;adeguata visualizzazione delle cellule. Generalmente una minore intensità è migliore. </li><li> Regolare la fascetta sul tubo in modo che il trasduttore legge un costante 30 mm Hg, correlando a media pressione di flusso fisiologico, o come desiderato. </li><li> Premere &quot;start&quot; per avviare la registrazione sia il video e la pressione con il primo time lapse vicino alla fine giugulare e muoversi contro il flusso verso l&#39;estremità carotide fino completata. NOTA: Diverse condizioni di rivestimento utilizzando diverse molecole di adesione possono essere studiati nello stesso mouse utilizzando camere multiple. Solo una camera è registrata in una volta. <ol><li> Quando la registrazione è terminata, chiudere la valvola nel sito di ingresso, fermando il flusso di sangue. Rimuovere la camera e inserire una nuova camera (rivestito con una diversa molecola di adesione) al circuito utilizzando una pinza sottile in una mano e pinze scanalati con l&#39;altra mano. Riprendere la registrazione per la nuova camera come indicato nei passi6,1-6,4. </li></ol></li><li> Euthanize tutti i topi da CO 2 asfissia seguita da una dislocazione del midollo spinale alla fine dell&#39;esperimento. La procedura viene terminale, quindi, i topi vengono sacrificati per dislocazione del midollo spinale alla fine dell&#39;esperimento. </li></ol> 7. Interpretazione dei risultati <ol><li> Per analizzare i dati registrati utilizzano il plugin &quot;M TrackJ&quot; per il software ImageJ 23. </li><li> Convertire il file in scala di grigi da selezionare File → Importa → → AVI convertire in scala di grigi. </li><li> Standardizzare le cornici Seleziona → un&#39;immagine → proprietà → per inserire gli intervalli di telaio (i) → globale. Calcolare gli intervalli telaio dividendo la durata complessiva video (di solito 30 sec) per il numero di frame in un video (indicato nell&#39;angolo superiore della finestra video J Image). </li><li> Misurare il flusso di ogni leucociti Select plug → M TrackJ → Aggiungi brani → selezionare un leucociti→ seguirli con ogni fotogramma per 15-20 sec → Merge. </li><li> Ripetere il punto 7.4 per tutti i leucociti in vista. </li><li> Determinare la velocità media di rotolamento dei leucociti da Select misura → due colonne → Copia appaiono tutte le M TrakJ: tracce in un foglio di calcolo. La colonna &quot;V significa&quot; è il rotolamento dei leucociti misurata in pixel / secondo. Convertire in micron / sec dividendo per 2/3. </li><li> Per analizzare l&#39;evidenziazione dei dati di pressione e di esportazione in un foglio di calcolo ed eseguire il seguente calcolo: Ap (mm Hg) e t (dyne / cm 2) per un confronto tra ciascun gruppo sperimentale. Una volta calcolato, copiare i dati in un software per la rappresentazione grafica del prisma. </li></ol>

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The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

Il processo di reclutamento dei leucociti è un passo cruciale nella risposta infiammatoria; comporta la migrazione dei leucociti dal sistema circolatorio verso tessuti bersaglio, dove sono in grado di esercitare la loro funzione effettrice. Il reclutamento dei leucociti è integrale in una varietà di condizioni infiammatorie come placche aterosclerotiche, infarto miocardico, ischemia / riperfusione e chirurgia dei trapianti 1, così come più CNS relative condizioni neuro-infiammatori 10-12,20,24,25. Considerando la diversità delle condizioni di malattia che si estende il reclutamento dei leucociti, la camera di microflusso autoperfused fornisce uno strumento indispensabile che consente al ricercatore la possibilità di studiare la dinamica di migrazione dei leucociti. Nel corso degli ultimi decenni, una serie di test in vitro sono stati sviluppati per studiare la dinamica dei leucociti cella adesione 26. Purtroppo, tutti questi saggi richiedono l&#39;estrazione dii leucociti dal sangue, introducendo attivazione meccanica. Per avvicinarsi all&#39;ambiente in vivo, sono stati effettuati adattamenti per raccogliere campioni di sangue intero e controllare le condizioni di flusso emodinamico 16,17. Qui, si estendono i progressi precedenti nel campo collegando una camera rivestita al sistema circolatorio del mouse. Possiamo regolare il flusso del sangue in un intervallo fisiologico e studiare la dinamica di leucociti rotolamento. La camera rivestita ci dà la possibilità di studiare le interazioni leucociti con specifiche molecole di adesione. Poiché il sistema funziona come unità azionata da un topo vivo, imita più strettamente l&#39;ambiente naturale, consentendo di studiare le interazioni leucociti-endotelio in una varietà di modelli di topo immunologici. Inoltre, questo sistema ci permette di trarre vantaggio dalle molteplici modelli murini genetiche disponibili. Mentre il sistema non replica completamente l&#39;ambiente in vivo, fornisce una piattaforma per studiare specifielementi c dei leucociti in condizioni fisiologiche, una prodezza che non è stato possibile in precedenza. Anche se questo ci porta un passo avanti verso un ambiente più fisiologica ci sono limitazioni al sistema. Essa non replica completamente la complessa matrice 3D della vascolarizzazione quindi siamo solo in grado di valutare alcuni elementi di interazioni leucociti che sono limitati al rivestimento della camera. Inoltre, grande attenzione dovrebbe essere presa per garantire un sistema chiuso per la circolazione del mouse seguendo tutti i passaggi indicati nel protocollo. L&#39;introduzione di bolle d&#39;aria influenzerà notevolmente la precisione e la riproducibilità degli esperimenti. Mentre si descrive l&#39;uso della camera Autoperfused Microflow per valutare le dinamiche di rotolamento dei leucociti la procedura ha il potenziale per essere personalizzato dagli investigatori di studiare una serie di malattie. Ad esempio, le cellule tumorali metastatizzano esprimendo molte delle integrine comuni condivisi dai leucociti. Studying loro dinamica di laminazione in un ambiente che imita più da vicino un ambiente in vivo potrebbe aiutare nella nostra conoscenza, e forse la previsione, la natura invasiva delle cellule tumorali. Un possibile approccio potrebbe essere quello di combinare una tecnica di etichettatura per le cellule tumorali, come GFP 27, insieme con il test camera di flusso per monitorare le dinamiche di rotolamento delle cellule tumorali esprimenti GFP. Data la flessibilità del rivestimento della camera con una varietà di sostanze e collegando camere multiple allo stesso topo sarà interessante vedere come questa procedura viene modificato per l&#39;utilizzo in altri laboratori in combinazione con topi geneticamente modificati e modelli di malattia. La tecnica che descriviamo qui tocca solo su una potenziale applicazione molto più ampio che è limitato solo dalla creatività del ricercatore.

L&#39;infiammazione è la risposta universale del corpo di infortunio ed è un passo cruciale sia la funzione del sistema immunitario innato e adattativo. In risposta al danno e / o stimoli infiammatori, le cellule endoteliali upregulate molecole di adesione specifici; questo porta a leucociti stravaso attraverso l&#39;endotelio microvascolare, soprattutto in venule post-capillari. Questo processo inizia con tethering dei leucociti flusso libero nel sangue sull&#39;endotelio. Rolling stabile e ferma adesione dei leucociti, che a sua volta conduce alla trasmigrazione e la secrezione di agenti citotossici, seguono questa legare 1,2. Selectine sono noti per mediare i primi passaggi della cascata 3-5; integrine sono responsabili per i passi successivi della ditta adesione e la trasmigrazione 1,6-8. Un crescente corpo di evidenza suggerisce leucociti e molecole di adesione endoteliali hanno un ruolo fondamentale in modelli animali di ischemia riperfusione, Asma, psoriasi, sclerosi multipla, e la degenerazione maculare senile 9-12. In queste condizioni, la risposta infiammatoria è indirizzato ad attaccare il proprio corpo, con conseguente rottura del tessuto sano. Agenti anti-infiammatori esistenti (come i farmaci non steroidei anti-infiammatori, corticosteroidi o altri agenti chemioterapici) comportano il rischio di gravi effetti collaterali con l&#39;uso a lungo termine 13. Pertanto, è di grande interesse per avere gli strumenti appropriati con la capacità di identificare molecole malattie specifiche, che alla fine possono essere mirati ad avere l&#39;effetto anti-infiammatorio desiderata rimanendo atossico 14. Esistenti metodi in vitro, come il test di adesione leucocitaria statico sono state usate come già nel 1976 15. La camera di flusso parallelo è stato impiegato in vitro nel 1987 per studiare le interazioni leucociti-endotelio in condizioni di flusso. In questi esperimenti, stimolato Human leucociti polimorfonucleati (PMN) dal sangue venoso sono stati perfusi su un monostrato di cellule primarie umane vena ombelicale endoteliali (HUVEC). Per controllare le condizioni di flusso emodinamico, la pompa a siringa Harvard Apparatus 16 è stato impiegato. In alternativa, per evitare l&#39;isolamento leucociti artificiale, sangue intero è stato usato in combinazione con la camera di vetro rivestito con molecole di adesione immobilizzati 17. Per evitare la stimolazione dei leucociti e studiare meccanicamente la loro interazione con le molecole di adesione in condizioni fisiologiche approssimativi, un ex vivo autoperfused, extracorporea, circuito artero è stato sviluppato 16. In questo circuito, il sangue scorre tra il diritto carotide comune e sinistra vena giugulare esterna di un topo vivo sotto anestesia, permettendo interazione di PBLs nativi entro una camera microflusso vetro rivestito con molecole singole o co-immobilizzato adesione. Uno dei principali vantaggi di questo system è la capacità di impiegare topi geneticamente ingegnerizzati, in cui vie infiammatorie sono manipolati direttamente o indirettamente. Inoltre, vi è la possibilità di individuare il contributo isolato di molecole di adesione leucocitaria all&#39;infiammazione, gratuitamente attivazione esterna, in condizioni di flusso. L&#39;applicazione di un regolatore di flusso al punto di ingresso della camera di flusso fornisce una vasta gamma di variazioni sperimentali di forze di taglio per mimare sia arterioso o venoso 18-22. Qui si descrive in grande dettaglio un protocollo sulla preparazione e le prestazioni della ex vivo autoperfused microflusso test camera.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Material</td>
			<td style="width:220px;">Vendor</td>
			<td style="width:237px;">Part number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro glass chamber 0.4x0.04x50mm</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>2540-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 60</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Silicone tubing 002</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-189-15A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y tube</td>
			<td>Value Plastics</td>
			<td>Y210-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T tube</td>
			<td>value plastics</td>
			<td>T410-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone gel</td>
			<td>Hardware store - Home Depo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11253-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Tube holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>00608-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Clamp applicator</td>
			<td>FST</td>
			<td>18057-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Vascular clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18055-04</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 silk sutures</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-1215-6/0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25x1G&#160; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30x1/2G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin 100 USP units/ml</td>
			<td>Hospital pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

Interazioni leucociti-endotelio sono precoci e importanti eventi in infiammazione acuta e cronica e può, quando deregolazione, mediare lesioni dei tessuti che porta a danni permanenti patologico. Esistenti saggi convenzionali consentono l&#39;analisi di molecole di adesione leucocitaria solo dopo l&#39;estrazione dei leucociti dal sangue. Questo richiede il sangue sottoporsi a diversi passaggi prima leucociti del sangue periferico (PBL) possono essere pronti per l&#39;analisi, che a sua volta può stimolare PBLs influenzano i risultati della ricerca. Il test camera di flusso micro autoperfused, tuttavia, consente agli scienziati di studiare i primi leucociti disregolazione funzionale al flusso sistemico di un topo vivo pur avendo la libertà di manipolare una camera rivestita. Attraverso un modello di malattia, l&#39;espressione funzionale di molecole di adesione leucocitaria può essere valutata e quantificata in una camera di micro-vetro rivestito con le molecole di adesione endoteliale immobilizzati ex vivo. In questo modello, il sangue scorretra il diritto carotide comune e sinistra vena giugulare esterna di un topo vivo sotto anestesia, permettendo l&#39;interazione di PBLs nativi nella camera. Analisi sperimentale in tempo reale è ottenuto con l&#39;aiuto di un microscopio intravitale, nonché un dispositivo di pressione Apparecchiatura Harvard. L&#39;applicazione di un regolatore di flusso al punto di ingresso della camera di vetro permette comparabili condizioni fisiologiche di flusso tra gli esperimenti. La velocità di rotolamento dei leucociti è il risultato principale e si misura con il National Institutes of Health open-access software ImageJ. In sintesi, il autoperfused micro test camera di flusso fornisce un ambiente fisiologico ottimale per studiare l&#39;interazione leucociti endoteliale e permette ai ricercatori di trarre conclusioni precise quando si studia l&#39;infiammazione.

<html> Durante ogni registrazione leucociti solo interagiscono sono evidenti sulla camera. I risultati di un esperimento rappresentativo può essere visto in Figura 4. Le frecce bianche indicano i singoli leucociti che sono stati catturati dalla molecola di adesione di interesse e sono a rotazione lungo la camera tra le altre quelle fluidità all&#39;interno del flusso sanguigno. Un artefatto comune fuori la camera può essere visto con le grandi sfere scure in tutte le immagini. Le sfere scuri aiutano il lettore apprezzare il movimento dei leucociti in relazione ad un punto fisso. Leucociti avanzamento per un periodo di 22 sec può essere visto in relazione alle sfere. Il grafico nella stessa figura mostra un grafico finale dei dati dove Tx1 diminuisce la velocità di rotazione (uno spostamento verso sinistra) e Tx2 aumenta la velocità (uno spostamento verso destra) rispetto al controllo. 0 &quot;/&gt; Figura 1: Preparazione del tubo per la camera di flusso. (A) Strumenti necessari per le tubazioni e il montaggio della camera (micro camera di vetro 0,4 x 0,04 x 50 mm, in polietilene tubi PE10, tubi in polietilene PE60, tubi di silicio 002, tubo Y, tubo T, 35 millimetri piatto di Petri, una pinza sottile, forbici sottili, supporto del tubo, morsetto vascolare, sutura di seta 7-0. (B) Preparazione della carotide e la vena giugulare tubi per re-indirizzare il mouse flusso di sangue attraverso la camera rivestito. (C) Collegamento l&#39;arteria carotide tubo al trasduttore di pressione. (D) Far passare il tubo dal trasduttore attraverso il morsetto per regolare la velocità del flusso sanguigno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /> Figura 2:. L&#39;esposizione del carotide e della vena giugulare (A) ha tagliato con cura la zona del collo per esporre la trachea (B) Pulire la carotide destra in modo che un pezzo di sutura può essere passato sotto l&#39;imbarcazione (punteggiato giallo. linea delinea la carotide). (C) Pulire la vena giugulare sinistra in modo che un pezzo di sutura può essere passato sotto la nave (linea gialla punteggiata delinea la vena giugulare). (D) organizza vagamente legato suture alle regioni superiori e inferiori della carotide e della vena giugulare (frecce indicano le regioni superiori e inferiori delle navi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> Figura 3: Collegamento del tubo a tegli carotide e della vena giugulare. (A) Stringere il nodo superiore sulla carotide e posizionare il morsetto sotto il nodo più basso. (B) Con i microscissors, fare una piccola incisione nella carotide, di circa 1/8 la circonferenza (punteggiata cerchio giallo indica l&#39;incisione). ( C) Inserire il tubo nella carotide e sicuro con almeno due suture (linea tratteggiata verde indica il tubo e la linea tratteggiata gialla carotide). (D) Analogamente inserire tubi in giugulare (linea tratteggiata verde indica il tubo e la giallo linea tratteggiata la vena giugulare). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> Figura 4: decorso Rappresentante dei leucociti rotolano attraverso il cham flussoBER (Scala bar = 100 micron) (frecce bianche indicano leucociti rotolamento). Il grafico illustra i risultati di rappresentanza dopo l&#39;esportazione in un programma di grafica (Tx1 e Tx2 sono gruppi di trattamento sperimentale e CTR è il gruppo di controllo). Tx1 rappresenta un trattamento in cui leucociti rallentare portando ad una diminuzione della velocità di leucociti e uno spostamento a sinistra del grafico rispetto al gruppo non trattato (CTR) laminazione, mentre Tx2 porta ad uno spostamento a destra che riflette un aumento della velocità di rotolamento leucociti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Qui, presentiamo un protocollo che permette al ricercatore di valutare dinamiche reclutamento di leucociti ex vivo collegando una camera rivestita con molecole di adesione endoteliali derivate al sistema circolatorio di un topo. Questo metodo offre notevoli vantaggi, in quanto permette di valutazione leucociti in condizioni biologiche relative.

Valutare interazioni leucociti-endotelio in condizioni di flusso in un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Assay Autoperfused Microflow Camera

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

assessing-leukocyte-endothelial-interactions-under-flow-conditions-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

9.5K Views.  Harvard Medical School, Massachusetts Eye & Ear Infirmary.  Qui, presentiamo un protocollo che permette al ricercatore di valutare dinamiche reclutamento di leucociti ex vivo collegando una camera rivestita con molecole di adesione endoteliali derivate al sistema circolatorio di un topo. Questo metodo offre notevoli vantaggi, in quanto permette di valutazione leucociti in condizioni biologiche relative. 

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Ricerca

Bioingegneria

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinazione del tasso di trasporto di xenobiotici e nanomateriali attraverso la placenta con il<em&gt; Ex vivo</em&gt; Umano Modello perfusione placentare

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

A Novel tridimensionale del flusso Camera dispositivo per studiare Chemokine-diretto stravaso di cellule circolanti in condizioni di flusso fisiologici

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Una nuova tecnica chirurgica come una Fondazione per In Vivo parziale ingegneria del fegato nel ratto

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Un metodo automatizzato per eseguire l'analisi in vitro micronucleoutilizzando la citometria del flusso di imaging multispettrale

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

Modelli arteriosi in vitro coltivati in cellule 3D per lo studio del targeting vascolare del farmaco sotto flusso

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Un sistema microfisiologico per studiare l'interazione leucocitaria-cellula endoteliale durante l'infiammazione

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.

Misurazione in vivo risolta nel tempo della dinamica dei neuropeptidi mediante immunosonda capacitiva nel cuore suino

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by scoring MN in once-divided, cytokinesis-blocked binucleated cells or fully divided mononucleated cells. Historically, light microscopy has been the gold standard method to score the assay, but it is laborious and subjective. Flow cytometry has been used in recent years to score the assay, but is limited by the inability to visually confirm key aspects of cellular imagery. Imaging flow cytometry (IFC) combines high-throughput image capture and automated image analysis, and has been successfully applied to rapidly acquire imagery of and score all key events in the MN assay. Recently, it has been demonstrated that artificial intelligence (AI) methods based on convolutional neural networks can be used to score MN assay data acquired by IFC. This paper describes all steps to use AI software to create a deep learning model to score all key events and to apply this model to automatically score additional data. Results from the AI deep learning model compare well to manual microscopy, therefore enabling fully automated scoring of the MN assay by combining IFC and AI.

The micronucleus (MN) assay is a well-established test for quantifying DNA damage. However, scoring the assay using conventional techniques such as manual microscopy or feature-based image analysis is laborious and challenging. This paper describes the methodology to develop an artificial intelligence model to score the MN assay using imaging flow cytometry data.

Automazione del test del micronucleo mediante citometria a flusso di imaging e intelligenza artificiale

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...